Субекти

Резюме

Известно е, че експресията на mRNA на MuRF-1 и атрогин-1/MAFbx се увеличава в мускула на плъхове при условия на разтоварване. Ние имахме за цел да определим ролята на хистонова деацетилаза 1 (HDAC1) в активирането на експресията на MuRF-1 и MAFbx в мускула на плъх в ранен етап на суспензия на задните крайници (HS). За тази цел мъжките плъхове Wistar (195–215 g) бяха разделени на 3 групи (n = 8/група): контролна (C), 3-дневна HS (HS) и 3-дневна HS + HDAC1 инхибитор CI-994 ( 1 mg/kg/ден) (HS + CI). Съдържанието на протеин и нивата на експресия на иРНК на регулаторните молекули се определят чрез Western-блотинг и RT-PCR. Лечението с CI-994 предотврати индуцираното от HS увеличаване на ядреното съдържание на HDAC1. Както се очаква, 3-дневният HS предизвика значително регулиране на MAFbx, MuRF-1 и убиквитин. Прилагането на CI-994 води до отслабване на HS-медиирано увеличение на нивата на експресия на MAFbx и убиквитин, но не засяга експресията на MuRF-1. Намаляването на ядреното съдържание на хистон ацетилтрансфераза p300 в групата на HS е предотвратено чрез приложението на CI-994. Няма значителни разлики в съдържанието на фосфорилирани анаболни сигнални молекули между HS група и HS + CI група. По този начин инхибирането на HDAC1 предотвратява HS-медиирано увеличение на експресията на MAFbx и убиквитин, но не засяга експресията на MuRF-1 гена.

Въведение

Ние предположихме, че активността на HDAC1 е в състояние да контролира експресията на mRNA на E3 убиквитин лигази (MuRF-1 и атрогин-1/MAFbx) в мускула на плъх в ранен етап на разтоварване. Чрез инхибиране на активността на HDAC1 с CI-994, ние имахме за цел да определим дали активността на HDAC1 ще повлияе на индукция на програма за мускулна атрофия в ранния етап на разтоварване на задните крайници. Ако нашата хипотеза е вярна, инхибирането на HDAC1 би довело до понижаване на регулацията на експресията на MuRF-1 и атрогин-1/MAFbx и последващо затихване на мускулната атрофия на солеуса. Както беше показано по-рано, значително увеличение на експресията на тРНК на E3 убиквитин лигази в мускула на солеуса се наблюдава през първия ден на разтоварване и достига пиковото ниво на експресия до 3-ия ден на разтоварване 14. Това е причината, поради която в настоящото проучване е избран 3-дневен период на разтоварване.

Идентифицирането на молекулярни механизми, които контролират разграждането на мускулните протеини по време на механично разтоварване, ще помогне за разработването на система от фармакологични интервенции, които биха могли да предотвратят или отслабят атрофията на скелетните мускули.

Материали и методи

Етично одобрение

Всички процедури с животните бяха одобрени от Комитета по етика на биомедицината на Института по биомедицински проблеми на Руската академия на науките/Секция по физиология на Руския комитет по биоетика (протокол 481, 12 юни 2018 г.). Всички експерименти бяха проведени в строго съответствие с насоките и препоръките в Ръководството за грижа и употреба на лабораторни животни от Националните здравни институти. Всички усилия бяха положени да минимизират болката и страданието на животните. Преди всички хирургични процедури, животните бяха обезболени с интраперитонеална инжекция с триброметанол (240 mg kg − 1). Дълбочината на анестезията беше оценена чрез тестване на рефлекса за оттегляне на педала (щипка на пръстите и краката).

Процедури с животни

Всички животни се държат при 22 ° C; вода и храна за гризачи бяха на разположение ad libitum. Двадесет и четири 2,5-месечни мъжки плъхове Wistar са получени от сертифицираната детска стая за лабораторни животни на Института по биоорганична химия на Руската академия на науките (Пущино, Московска област). Плъховете бяха разпределени на случаен принцип в групата за контрол на клетката (C) (n = 8), групата за суспензия на задните крайници (HS) (n = 8) и инхибиторът на HS + HDAC1 CI-994, Selleckchem, САЩ, (1 mg/kg дневно по време на 3-дневен HS ip в 2,5% диметил сулфоксид (DMSO; Sigma, St Louis, MO, USA) в 0,9% физиологичен разтвор, (HS + CI група, n = 8). По-рано беше показано, че тази доза CI-994 води до инхибиране на HDAC1 15. Контролните и HS животни са получили идентични обеми 2,5% DMSO носител. Експериментът с HS продължи 3 дни. Контролните животни бяха настанени в групи от по три в контролирана от температура и светлина среда (т.е. 12 часа светло-тъмен цикъл). В края на експеримента плъховете бяха евтаназирани с триброметанол (10 mg/kg) и мускулите на солеуса бяха бързо отстранени, претеглени и замразени в течен азот до по-късен анализ. Контролните животни бяха обработени заедно с HS и HS + CI животни.

Протокол за спиране на Hindlimb

Животните бяха подложени на условия за разтоварване, използвайки HS 16,17. Подробно описание на протокола HS може да се намери в предишните ни доклади 9,10 .

Екстракция на протеини и Western blot анализ

РНК анализ

RT-PCR анализът е извършен, както е съобщено по-рано 10. Накратко, общата РНК беше извлечена от 10 mg замразени мускули на солеуса с помощта на RNeasy Micro Kit (Qiagen, Hilden, Германия). Концентрацията на РНК се определя при 260 nm. За всяка прицелна иРНК, 1 µl сДНК се усилва в 25 µl SYBR Green PCR реакция, съдържаща 1x Quantitect SYBR Green Master Mix (Syntol) и 10 µM от всеки праймер: 5′-CTACGATGTTGCAGCCAAGA-3 ′ и 5′-GGCAGTCGAG AAGTCCAGTC-3 ′ За MAFbx; 5′-GCCAATTTGGTGCTTTTTGT-3 ′ и 5′-AAATTCAGT CCTCTCCCCGT-3 ′ за MuRF-1; 5′-CACCAAGAAGGTCAAACAGGA-3 ′ и 5′-GCAAGA ACTTTATTCAAAGTGCAA-3 ′ за убиквитин, 5′-ACGGCAAGTTCAACGG CACAGTCAA-3 ′ и 5′-GCTTTCCAGAGGGGCCATCCACA-GACTG 5′-TCATGAAGTGTGACGTT GACATCC-3 ′ и 5′-GTAAAACGCAGCTCAGTAACAGTC-3 ′ за β-актин. Пробите, които трябва да бъдат сравнени, се провеждат при подобни условия (количества на шаблона, продължителност на PCR цикли). Амплификацията се наблюдава в реално време, като се използва многоцветната PCR система за откриване iQ5 в реално време (Bio-Rad Laboratories, САЩ). Като домакински гени са използвани β-актин и GAPDH.

Статистически анализ

Всички PCR данни са изразени като медиана и интерквартилен диапазон (0,25–0,75). Статистическият анализ беше извършен с помощта на програмите REST 2009 v.2.0.12 (Qiagen, Германия) и Origin Pro v.8.0 (OriginLab Corp., Northampton, MA, USA). Всички данни от Western blot са изразени като средни стойности ± SE. значими разлики между групите бяха статистически анализирани с помощта на двупосочен ANOVA, последван от теста на Tukey. Когато тестването за нормалност се провали, данните се анализират чрез непараметрични методи (Kruskal-Wallis ANOVA, последван от теста на Dunnett). Разлики със стойностите на P

Резултати

Теглото на експерименталните плъхове е 195–215 g в края на експеримента и не се различава значително между групите. Установихме значително намаление от 10% (p Фигура 1

регулира

Представителни вестерн-блотове за Calpain-1, HDAC1, P300, Ac-H3, GAPDH и Lamin B в цитоплазматични и ядрени фракции.

Значително увеличение на фосфорилирания коефициент на удължаване 2 (eEF2)/общо съотношение eEF2 се наблюдава в групите HS и HS + CI в сравнение с групата C (Фиг. 4).

Нивата на експресия на съдържанието на E3 убиквитин лигази MuRF1 и атрогин-1/MAFbx са значително увеличени и в двете ненатоварени групи (HS и HS + CI) спрямо С групата (Таблица 1). В същото време в групата HS + CI нивото на експресия на mRNA Atrogin - 1/MAFbx е значително по-ниско, отколкото в групата HS (Таблица 1), докато нивата на експресия на mRNA MuRF1 не показват никакви разлики между двете разтоварени групи ( Маса 1).

Нивото на фосфорилиране на FOXO3 беше еднакво намалено и в двете ненатоварени групи спрямо С групата (Фиг. 5В). Същият модел на фосфорилиране се наблюдава и при Akt, за който е известно, че фосфорилира FOXO3 (фиг. 5А).

Установихме, че съдържанието на HDAC1 в ядрената фракция е значително увеличено (p Фигура 6

Съдържанието на хистон Н3 ацетилиран в N-терминална опашка (Ac-H3) в ядрото (открито с анти-ацетил-хистон Н3 антитяло) беше рязко увеличено в групата HS + CI спрямо C и HS групите (Фигури 3 и 8). В същото време ядреното съдържание на хистонова ацетилтрансфераза p300 беше намалено само в групата с HS спрямо групата С (Фигури 3 и 9). Прилагането на HDAC1 инхибитор по време на 3-дневна HS предотвратява намаляването на p300 ядреното съдържание в мускула на плъха (Фигури 3 и 9).

Дискусия

Предишен доклад предполага, че намаляването на скелетната мускулна маса може да настъпи през ранните етапи (2–4 дни) на разтоварване 19. Ефектът на инхибиране на HDAC1 върху съотношението тегло към теглото на солеуса, който се наблюдава в настоящото проучване, се проявява в ранния стадий на HS (3 дни).

В скелетните мускули UPS е отговорен за разграждането на саркомерните протеини с промени в двигателната активност 20. Повишената убиквитинация допринася за развитието на мускулна атрофия. Съдейки по експресията на убиквитин (Таблица 1), изглежда, че в HS групата този процес е много по-бърз, отколкото в другите две групи, но администрацията на CI-994 го забави. Калпаините могат да служат като отправна точка, предизвиквайки по-нататъшно убиквитиране на протеини по време на механично разтоварване на скелетните мускули 11. В същото време системите за калпаин и UPS не винаги работят съгласувано по време на мускулна атрофия 21. Установихме, че експресията на калпаин в групите HS и HS + CI е значително по-висока от тази в групата С (Фигури 2 и 3), поради което може да се предположи, че инхибирането на HDAC1 не влияе върху съдържанието на калпаин-1 по време на HS, и е малко вероятно да бъде свързано с разликите в степента на атрофия между групите HS и HS + CI.

Известно е, че фосфорилирането на eEF2 чрез удължаване фактор 2 киназа (eEF2K) киназа регулира надолу транслационното удължаване 22. Тъй като нивото на фосфорилиране на eEF2 е значително повишено и в двете ненатоварени групи спрямо групата С (фиг. 4), може да се предположи, че HDAC1 не участва в регулирането на този процес.

Заключение

За първи път показахме, че (i) HDAC1 контролира експресията на E3 лигаза Atrogin-1/MAFbx в мускула на плъх при механично разтоварване и (ii) инхибирането на HDAC1 може да отслаби атрофията на скелетните мускули. Не е изключено контролът върху експресията на атрогин-1 иРНК (заедно с фосфорилиране/дефосфорилиране на FOXO3a) да се извършва чрез ацетилиране/деацетилиране при 3-дневно разтоварване на задните крайници.

Препратки

Bodine, S. C. & Baehr, L. M. Атрофия на скелетните мускули и E3 убиквитиновите лигази MuRF1 и MAFbx/atrogin-1. Am. J. Phys. Край. Metab. 307, 469–484 (2014).

Glass, D. J. Сигнални пътища, които медиират хипертрофия и атрофия на скелетните мускули. Нат. Cell Biol. 5, 87–90 (2003).

Glass, D. J. Сигнални пътища за хипертрофия на скелетните мускули и атрофия. Международна J. Biochem. Cell Biol. 37, 1974–1984 (2005).

Jackman, R. W. & Kandarian, S. C. Молекулярната основа на атрофия на скелетните мускули. Am. J. Physiol. Клетъчен физиол. 287, 834–43 (2004).

Коен, S. и др. По време на мускулна атрофия дебелите, но не тънки, нишковидни компоненти се разграждат от MuRF1-зависимо повсеместно разпространение. J. Cell Biol. 185, 1083–95 (2009).

Соломон, В. и Голдбърг, А. Л. Значение на АТФ-убиквитин-протеазомния път при разграждането на разтворимите и миофибриларните протеини в екстракти от заешки мускули. J. Biol. Chem. 271, 26690–7 (1996).

Brocca, L. и др. Зависимите от FoxO атрогини се различават при катаболни условия и играят ключова роля в мускулната атрофия, предизвикана от суспензия на задните крайници. J. Physiol. 595, 1143–1158 (2017).

Khalil, R. Ubiquitin-Proteasome Pathway and Muscle Atrophy. Adv. Опит Med. Biol. 1088, 235–248 (2018).

Belova, S. P., Shenkman, B. S., Kostrominova, T. Y. & Nemirovskaya, T. L. Парадоксален ефект на инхибирането на IKKβ върху експресията на E3 убиквитинови лигази и индуцирана от разтоварване атрофия на скелетните мускули. Физиол. Представител. 5, 13291 (2017).

Lomonosova, Y. N., Shenkman, B. S. & Nemirovskaya, T. L. Затихване на индуцирана от разтоварване атрофия на солеус на плъх с индуктор на топлинен шок 17- (алиламино) -17-деметоксигелданамицин. FASEB J. 26, 4295–301 (2012).

Shenkman, B. S., Belova, S. P., Lomonosova, Y. N., Kostrominova, T. Y. & Nemirovskaya, T. L. Калпаин-зависима регулация на атрофия на скелетната мускулатура след разтоварване. Арх. Biochem. Biophys. 584, 36–41 (2015).

Мореси, V. и др. Миогенинът и HDAC от клас II контролират неврогенната мускулна атрофия чрез индуциране на Е3 убиквитин лигази. Клетка. 143, 35–45 (2010).

Бехари, А. У. и др. HDAC1 активира FoxO и е едновременно достатъчен и необходим за атрофия на скелетните мускули. J. Cell. Sci. 127, 1441–53 (2014).

Качаева, Е. В. и Шенкман, Б. С. Различни задачи на протеолитичните ензими в скелетните мускули по време на разтоварване: факти и предположения. J. Biomed. Биотехнол. 2012 г., 493618 (2012).

Секи, М. и др. Инхибиране на хистонова деацетилаза от клас I за лечение на продължително предсърдно мъждене. J. Pharmacol. Опит Тер. 358, 441–9 (2016).

Морей-Холтън, Е. Р. и Глобус, Р. К. Модел за разтоварване на гризачи на Hindlimb: технически аспекти. J. Appl. Физиол. 92, 1367–1377 (2002).

Новиков, В. Е. и Илин, Е. А. Реакции, свързани с възрастта на костите на плъхове към тяхното разтоварване. Авиат. Космическа среда. Med. 52, 551–553 (1981).

Вилчинская, Н. А. и др. Бързото намаляване на експресията на mRNA на MyHC I (β) в плъх по време на разтоварване на задните крайници е свързано с дефосфорилирането на AMPK. J. Physiol. 595, 7123–7134 (2017).

Giger, J. M., Bodell, P. W., Zeng, M., Baldwin, K. M. & Haddad, F. Бърза реакция на мускулна атрофия към разтоварване: предтранслационни процеси, включващи MHC и актин. J. Appl. Физиол. 107, 1204–1212 (2009).

Бодин, С.С. и др. Идентифициране на убиквитинови лигази, необходими за атрофия на скелетните мускули. Наука. 294, 1704–1708 (2001).

Fareed, M. U. и др. Лечението на плъхове с инхибитори на калпаин предотвратява индуцирана от сепсис мускулна протеолиза, независима от експресията на атрогин-1/MAFbx и MuRF1. Am. J. Physiol. Регул. Integr. Комп. Физиол. 290, 1589–97 (2006).

Redpath, N. T., Foulstone, E. J. & Proud, C. G. Регулиране на транслационния фактор на удължаване на транслацията-2 чрез инсулин чрез сигнален път, чувствителен към рапамицин. EMBO J. 15, 2291–2297 (1996).

Bonaldo, P. & Sandri, M. Клетъчни и молекулярни механизми на мускулна атрофия. Дис. Модел. Мех. 6, 25–39 (2013).

Hanson, A. M., Harrison, B. C., Young, M. H., Stodieck, L. S. & Ferguson, V. L. Надлъжна характеристика на функционални, морфологични и биохимични адаптации в скелетните мускули на мишката със суспензия на задния крайник. Мускулен нерв. 48, 393–402 (2013).

Кларк, Б. А. и др. E3 Ligase MuRF1 разгражда протеина на тежката верига на миозина в третирания с дексаметазон скелетен мускул. Клетка. Metab. 6, 376–385 (2007).

Attaix, D. & Baracos, E. V. Експресията на MAFbx/Atrogin-1 е лош индекс на мускулна протеолиза. Curr. Становище. Clin. Nutr. Metab. Грижа. 13, 223–224 (2010).

Сандри, М. и др. Транскрипционните фактори на Foxo индуцират свързаната с атрофия убиквитин лигаза атрогин-1 и причиняват атрофия на скелетните мускули. Клетка. 117, 399–412 (2004).

Du Bois, P. и др. Ангиотензин II предизвиква атрофия на скелетната мускулатура чрез активиране на TFEB-медиирана експресия на MuRF1. Кръг. Рез. 117, 424–36 (2015).

Bertaggia, E., Coletto, L. & Sandri, M. Посттрансляционните модификации контролират активността на FoxO3 по време на денервация. Am. J. Physiol. Клетка. Физиол. 302, 587–96 (2012).

Senf, S. M., Sandesara, P. B., Reed, S. A. & Judge, A. R. p300 Ацетилтрансферазна активност диференцирано регулира локализацията и активността на FOXO хомолозите в скелетните мускули. Am. J. Physiol. Клетка. Физиол. 300, 1490–501 (2011).

McKinsey, T. A., Zhang, C. L. & Olson, E. N. Контрол на мускулното развитие чрез дуел HATs и HDACs. Curr. Становище. Genet. Dev. 11., 497–504 (2001).

Благодарности

Тази работа беше подкрепена от Руската научна фондация (Проект RSF № 18-15-00062). Авторите на тази статия удостоверяват, че спазват етичните насоки за авторство и публикуване в списанието.

Информация за автора

Принадлежности

Институт по биомедицински проблеми, РАН, Хорошевское ш. 76а, 123007, Москва, Русия

Екатерина П. Мочалова, Светлана П. Белова, Тимур М. Мирзоев, Борис С. Шенкман и Татяна Л. Немировская

Можете също да търсите този автор в PubMed Google Scholar

Можете също да търсите този автор в PubMed Google Scholar

Можете също да търсите този автор в PubMed Google Scholar

Можете също да търсите този автор в PubMed Google Scholar

Можете също да търсите този автор в PubMed Google Scholar

Вноски

T.L.N .: дизайн на проучване; събиране, анализ и интерпретация на данни; писане и предаване на ръкописа. B.S.S .: дизайн на проучване; анализ и интерпретация на данни; писане и предаване на ръкописа. T.M.M .: писане и подготовка на ръкописа; S.P.B. и E.P.M .: провеждане на експерименти, събиране, анализ и интерпретация на данни; придобиване на данни.

Автора за кореспонденция

Етични декларации

Конкуриращи се интереси

Авторите не декларират конкуриращи се интереси.

Допълнителна информация

Бележка на издателя: Springer Nature остава неутрален по отношение на юрисдикционните претенции в публикувани карти и институционални принадлежности.