Отдел за остри и хронични грижи, Колеж по медицински сестри, Университет в Тенеси, Научен център по здравеопазване, Мемфис, Тенеси, Съединени американски щати, Национален институт за медицински изследвания, Национални здравни институти, Бетезда, Мериленд, Съединени американски щати

експресионните

Отделение за остра и хронична помощ, Колеж по медицински сестри, Университет в Тенеси, Научен център по здравеопазване, Мемфис, Тенеси, Съединени американски щати

Отдел по биостатистика и епидемиология, Университет на Тенеси, Научен център за здраве, Мемфис, Тенеси, Съединени американски щати

Отделение по биология на Университета в Мемфис, Мемфис, Тенеси, Съединени американски щати

Отделение по биология на Университета в Мемфис, Мемфис, Тенеси, Съединени американски щати

Институт по трансплантация на Университетска болница, Мемфис, Тенеси, Съединени американски щати, Отдел по трансплантации, Катедра по хирургия, Медицински център на университета в Тенеси, Мемфис, Тенеси, Съединени американски щати

Отделение за остра и хронична помощ, Колеж по медицински сестри, Университет в Тенеси, Научен център по здравеопазване, Мемфис, Тенеси, Съединени щати

Отделение по биология на Университета в Мемфис, Мемфис, Тенеси, Съединени американски щати

  • Ан Мода,
  • Ансли Станфил,
  • Фридтьоф Томас,
  • Lijing Xu,
  • Томас Сътър,
  • Джеймс Ийсън,
  • Манг Енсел,
  • Рамин Хомауни

Фигури

Резюме

Заден план

Целта на това проучване е да се изследва връзката на профилите на генна експресия в подкожната мастна тъкан с промяна на теглото при реципиенти на бъбречна трансплантация и да се придобие представа за основните механизми на увеличаване на теглото.

Методология/Основни констатации

Направен е вторичен анализ на данни върху подгрупа (n = 26) от съществуващи данни за клинична и генна експресия от по-голямо проспективно надлъжно проучване, изследващо фактори, допринасящи за увеличаване на теглото при реципиенти. Взетите измервания включват профили на експресия на гени на мастна тъкан по време на трансплантация, изходно и шестмесечно тегло и демографски данни. Използвайки многовариатен анализ на линейна регресия, контролиран за раса и пол, нивата на експресия на 1553 гена са значително (р 5% от изходното ниво) на 6 месеца след трансплантацията в сравнение с кавказки пациенти (27%, n = 3). Седем от 26 субекта са били диагностицирани с диабет тип 2 преди трансплантацията, на един индивид е диагностициран диабет с ново начало след трансплантация; по този начин 31% (n = 8) са имали диабет на 6 месеца.

Профилиране на генната експресия

Нивата на експресия на гени в мастната тъкан на 26 реципиенти на трансплантирани бъбреци бяха изследвани с помощта на масиви Affymetrix Human Gene 1.0 ST. Използвайки регресионен модел, който контролира раса и пол, открихме 1936 цели на сонда, съответстващи на 1553 уникални гена, чиито нива са значително корелирани с промяната на теглото на 6 месеца след трансплантацията (Таблици 2 и 3, Фигура 1 и Таблица S1) . Важно е да се отбележи, че е налице значителна вариабилност в генната експресия в тази кохорта. Това беше демонстрирано както от йерархично групиране, така и от анализ на основните компоненти на сондите от 1936 г. (Фигура 2 и Фигура 3). Например, няколко индивида, които не спечелят тегло (като # 16 и # 33), показват профили на изразяване, подобни на тези, които печелят тегло. Обратно, няколко индивида, които печелят тегло (като # 26 и # 61), показват профили на изразяване, които са подобни на тези, които не печелят, въз основа на йерархично групиране (Фигура 2). Изменчивостта на израза не е свързана с пол или раса.

Набор от 12 и 21 гени, свързани със затлъстяването, които са положително (A) и отрицателно (B) корелирани съответно с относителна промяна на теглото. Всеки ред представлява средната нормализирана стойност на експресия (вертикална ос) за даден ген при 26 получатели на бъбречна трансплантация, подредени по отношение на загуба/наддаване (хоризонтална ос) на 6 месеца след трансплантацията.

Представяне на топлинна карта на стойности на експресия за гени (редове) през получатели (колони), при което ниската експресия се обозначава със зелено, а високата експресия с червено. Експресията на всеки ген се нормализира във всички проби. Получателите бяха категоризирани в печалби за тегло (G, цвят на праскова) или не-печалби (G, син цвят), ако тяхното нетно изменение на теглото беше съответно по-голямо или по-малко от 5%, на 6 месеца след трансплантацията.

Приблизително 64%, 17% и 10% от променливостта се дължат съответно на основните компоненти 1, 2 и 3. Легенда: промяна на теглото страхотна> 5% на 6 месеца след трансплантацията, червено; Промяна на теглото Таблица 2. Експресионни р-стойности за гени, чиито нива на експресия са положително корелирани с увеличаване на теглото.

За да добием представа за потенциалния (те) механизъм (и), който е в основата на наддаването на тегло, извършихме функционален анализ на диференциално експресирани гени, използвайки два различни биоинформативни подхода. Първо определихме кои функционални класификации в GO или KEGG са обогатени в нашия генен набор, използвайки публично достъпен набор от инструменти, наречен WebGestalt (Таблица 4 и Таблица 5). Сред 1553 гена, корелирани с промяна на теглото, GO анализ откри 38 гена, отнасящи се до вътрешната мембрана на митохондриите (p Таблица 4. Функционални категории в генната онтология, които са значително обогатени в гените, свързани с увеличаване на теглото.

След това изследвахме мрежите за молекулярно взаимодействие, използвайки инструмента за анализ на интелигентността на пътя (Ingenuity systems, www.ingenuity.com) за първите 41 гена, които бяха или изрично, или имплицитно свързани с ключовата дума „затлъстяване“ в GeneIndexer. Най-добре класираната мрежа включва 22 от 41 гена, свързани със затлъстяването (Фигура 4). За отбелязване е, че тази мрежа показва директни взаимодействия между гени CPE, APOM, SERPINA12, CRP, NPY1R и NPY5R с лептин (LEP). Като цяло тези и други гени в мрежата изглежда се сближават в инсулин, съдов ендотелен растежен фактор (VEGF), хормон на растежа и сигнални пътища за IL-1, за които е известно, че играят важна роля в регулирането на метаболизма.

Мрежа, идентифицирана от софтуера Ingenuity от анализа на 41-те най-високо класирани гени, идентифицирани като корелирани с увеличаване на теглото от данни от микрочипове и също така силно свързани със затлъстяването в литературата от GeneIndexer. Гените CPE, NPY1R, NPY5R и APOM предполагат, че тези субекти могат да покажат промени в гените на лептин и инсулинов отговор преди натрупването на тегло след трансплантацията.

Дискусия

Увеличаване на теглото при получатели на бъбречна трансплантация

Генът CPE кодира ензима карбоксипептидаза Е, който е силно експресиран във висцерални мастни натрупвания при затлъстели лица [20]. CPE разцепва пептидни връзки и участва в биосинтеза на няколко пептидни хормона, участващи в енергийния баланс, включително инсулин. Предполага се също, че CPE променя обработката на проопиомеланокортин (POMC) в хипоталамуса, което спомага за регулиране на енергийния баланс в отговор на циркулиращите нива на лептин и инсулин [21]. Промените във всеки от тези сигнални пътища могат да доведат до повишено тегло. Всъщност CPE нокаутиращите мишки имат почти два пъти телесната мазнина от дивия тип отпадъци, имат намаление в разграждането на тази мазнина за енергия и имат по-високи нива на циркулиране на лептин и проинсулин [22].

CPE се свързва и с активността на транспортера на допамин [23]. Допаминът е невротрансмитер, който може да играе роля в приятните (възнаграждаващи) аспекти на храненето. По този начин CPE не само играе роля в енергийния баланс, но също така играе роля и в емоционалните аспекти на храненето. От анализа на генната онтология, нашите реципиенти на бъбречна трансплантация показаха статистически значимо повишена експресия в 5 други гена (р 2 преди трансплантацията и по този начин бяха класифицирани като затлъстели от Националните здравни институти за ИТМ. Всички субекти бяха на подобни протоколи за имуносупресорна терапия по време на 6 месеца след трансплантацията. Непосредствено след трансплантацията 80% (n = 21) са били на 20 милиграма (mg) преднизон, 8% (n = 2) са били на 10 mg преднизон, 8% (n = 2) са били на 15 mg преднизон и 4% (n = 1) са били върху 50 mg преднизон.На 6 месеца 92% (n = 24) са били на 5 mg преднизон, а 8% (n = 2) не са приемали преднизон.

Анализ на експресия на РНК

Събирането, обработката и съхранението на подкожната подкожна мастна тъкан са описани подробно по-рано [31]. Накратко, пробите бяха събрани интраоперативно от стандартизирано място при получатели на бъбречна трансплантация по време на бъбречна трансплантация. Адипозните проби са получени от коремния разрез от трансплантационния хирург с помощта на скалпели. Пробите незабавно се поставят в чаша на Петри върху лед, преместват се извън операционната, нарязват се на 10 секции, поставят се в отделни крио флакони и след това се замразяват в течен азот. За да се запази целостта на РНК, времето от събирането до замръзването беше по-малко от две минути. След това пробите, замразени в течен азот, се транспортират до съоръжение и се поддържат при -80 ° C за съхранение. РНК се изолира с помощта на TRizol плюс RNeasy Lipid Kit. Количеството РНК е тествано от спектрофотометър NanoDrop® ND-1000 (NanoDrop Technologies, Inc., Wilmington, DE). Чистотата на РНК е тествана от биоанализатор Agilent 2100 (Agilent Technologies, Санта Клара, Калифорния). И накрая, нивата на експресия на РНК бяха измерени с помощта на Affymetrix Human Gene 1.0 ST GeneChips® (Санта Клара, Калифорния).

qPCR беше използван за валидиране на резултатите от микрочиповете. РНК се екстрахира, използвайки метода Trizol, от допълнителни замразени проби от всеки от 26-те субекта и cDNA се прави от комплекта за синтезиране на cDNA от първата нишка на Transcriptor (Roche Applied Science, Indianapolis, IN). qPCR е направен по метода Taqman® на Lightcycler®480. За потвърждаване на резултатите са използвани пет от най-ниските р-стойности на гените от микрочипове и два целеви гена, представляващи интерес от откритията на микрочиповете [32]. Всеки ген се нормализира към референтния ген, използвайки метода ΔCt [33], и след това се осреднява за всички 26 субекта, за да се получи среден ΔCt. След това тази средна ΔCt се корелира, като се използва корелация на продукта на Pearson с резултатите от микрочиповете. Тези резултати са показани в таблица S3.

Анализ на данни

Относителната промяна на теглото на пациентите на 6 месеца след трансплантацията е регресирана на нивата на генна експресия в изходното ниво, като същевременно се контролира пола и расата. (Маргиналните) р-стойности на регресионния коефициент, свързани с нивата на генна експресия, бяха използвани за изчисляване на q-стойности, използвайки софтуера, наличен в R [34]. Стойността q е аналогът на положителната скорост на фалшиво откриване (FDR) на р-стойността и се определя като очаквания дял на фалшивите положителни резултати сред всички отхвърляния на нулевата хипотеза. Открихме 1936 сонди (съответстващи на 1553 уникални гена), които имаха регресия р-стойност 0,2 обикновено показва изрична асоциация (напр. Думата всъщност се появява в генните абстракти) и резултат между 0,1 и 0,2 обикновено показва подразбираща се връзка [37 ]. Набор от 14 неврологични и свързани със затлъстяването концепции за ключови думи бяха ръчно избрани от изследователския екип и оценени чрез групиране с помощта на софтуера Partek (St Louis, MO) въз основа на резултатите от асоциацията на литературата, получени от GeneIndexer (Фигура S1). След това използвахме софтуера Ingenuity, за да извършим мрежов анализ на 41-те най-високо класирани гени, идентифицирани от GeneIndexer като имащи явни или неявни връзки с ключови думи за затлъстяване. Най-известната мрежа е показана на Фигура 4.

подкрепяща информация

Таблица S1.