Клетките непрекъснато се генерират и елиминират от нашите тела в непрекъснат цикъл, решаващ за поддържането на правилната тъканна структура и функция. Смъртта на клетките по време на нормалното поддържане на тъканите води до освобождаване на вътреклетъчен ДНК материал в кръвния поток, където той свободно циркулира. Всъщност здравите индивиди могат да имат до 100 нанограма некапсулирани ДНК фрагменти, които се носят във всеки милилитър от кръвта им. 1 Безклетъчната циркулираща ДНК или накратко cfDNA се оказа доста полезна в различни клинични приложения, включително оценка на бременността от фетална cfDNA в майчината кръв, мониторинг на трансплантации на органи от донорна cfDNA в кръвта на реципиента и диагностика на рак от тумор cfDNA в така наречените „течни биопсии“.

циркулиращата

Болести като захарен диабет и множествена склероза се характеризират с хронично унищожаване на определени клетъчни типове (β-клетки, олигодендроцити), което води до загуба на критични функции (секреция на инсулин, производство на гликопротеин MOG), необходими за поддържане на живота на биологични процеси (глюкозна хомеостаза, Миелинизация на ЦНС). Такава насочена клетъчна смърт често остава неоткрита в ранните фази на прогресиране на заболяването, когато терапевтичната интервенция би била най-полезна, преди да настъпи значителна и необратима загуба на тъканната функция. Тъй като тези клетки умират, генетичното им съдържание се изхвърля в циркулация и се смесва с cfDNA, която вече присъства от физиологичния клетъчен обмен.

Въпреки че всички клетки на нашето тяло по същество съдържат едни и същи гени, експресията на тези гени е тъканно специфична и строго регулирана от епигенетични фактори като ДНК метилиране и модификации на хистон. По този начин епигеномът на cfDNA може да се използва за определяне на точния източник, от който произхожда cfDNA. Например, хипометилирането на CpG мотиви в инсулиновия промотор отличава cfDNA, получена от β-клетки, от не-β-клетъчна ДНК, протичаща през кръвния поток. 2 Олигодендроцитната cfDNA в серуми от пациенти с активна рецидивиращо-ремитираща множествена склероза се разпознава по своята деметилирана MOG кодираща област. 3 Способността да се разкриват и лекуват патологични състояния преди началото на заболяването със сигурност би подобрила резултатите за пациентите, а диференциално метилираната cfDNA може да служи като удобен биомаркер за ранно откриване на свързана със заболяването клетъчна смърт in vivo.

Обработката и анализът на диференциално метилирана cfDNA е многостепенна процедура, която обикновено включва извличане на ДНК, химическа модификация на генетичния регион от интерес за различаване между метилирани и неметилирани места и усилване както на модифицираната, така и на немодифицираната целева последователност до измерими нива. Първата стъпка е ефективното изолиране и пречистване на cfDNA. Съвременните методи за изолиране на cfDNA се основават на улавянето на ДНК чрез свързване на силиконова колона, разделяне на фенол-хлороформ или силициеви топчета и са склонни да отнемат много време и ниска производителност. Иновативната технология за фракциониране с размер на магнитни зърна предлага по-прост и бърз начин за получаване на високо възстановяване на чиста cfDNA. По-специално, метилирани ДНК фрагменти могат да бъдат избрани и обогатени чрез базирани на метилирана ДНК имунопреципитационни системи, използващи висококачествени и нереактивни антитела.

Следващата стъпка е да се подготви изолираната cfDNA за генно-специфичен анализ на метилирането. Това обикновено включва извършване на бисулфитна конверсия, химична реакция, при която неметилираните цитозини се дезаминират до урацил, като оставят 5 mC непокътнати (ДНК метилирането ковалентно добавя метилови групи в 5-въглеродното положение на цитозиновите пръстени, за да образува 5-метилцитозин или 5-mC) . В резултат на това метилирани и неметилирани cfDNA цитозинови остатъци се диференцират един от друг. Традиционният метод на преобразуване изисква продължително протоколно време (12-16 часа), причиняващо тежко разграждане на ДНК (> 80%), високо неподходящо 5-mC дезаминиране (> 3,5%) и ниска скорост на превръщане на цитозин (превръщането на бисулфит включва превръщане на цитозин в урацил, оставяйки 5-метилцитозин (5-mC) непокътнат. Кредит: EpiGentek

Усилията за кондензиране на целия бисулфитен процес до само 0,5-1,5 часа значително подобриха ефективността на преобразуване на цитозин (> 99,9%) и ефективно предотвратиха деградацията на ДНК, третирана с бисулфит. Хидроксиметилираният 5-mC, или 5-hmC, е друга епигенетична марка на cfDNA, която събира изследователски интерес 4, а съвременната технология позволява едновременното идентифициране на двете метилирани цитозинови форми. Чрез свързване на бисулфит, насочен към неметилирани С остатъци, с последваща обработка с дезаминаза APOBEC, която селективно променя 5-mC на тимин, 5-hmC е съответно дискриминирана. Преобразуваната cfDNA вече е готова за по-задълбочено изследване, обикновено чрез PCR и методите за секвениране от следващо поколение, за да се разрешат точните места на метилиране в целевия регион на ниво еднобазова резолюция.

Медицинските процедури могат да бъдат доста скъпи и изключително натрапчиви, много за неудобството и дискомфорта на пациента. Инвазивните лумбални пункции за извличане на цереброспинална течност и скъпите ЯМР са физически и финансово тежки за тези, страдащи от множествена склероза, например. Диференциално метилираната cfDNA осигурява неинвазивна и евтина алтернатива на конвенционалната диагностика. Само от малка кръвна проба могат да бъдат изолирани и идентифицирани следи от ДНК чрез техния уникален епигеном с висока степен на чувствителност и специфичност. Техниките, базирани на метилиране, могат да се използват, за да се определи произходът на cfDNA и да се оценят техните кръвни нива сред морето от циркулиращи фрагменти от нуклеинова киселина, което помага за точно и точно диагностициране и наблюдение на съответната патология. В комбинация с епигенетичен аналитичен подход, диференциално метилираната cfDNA предоставя нови възможности за клинично одобрени молекулярни биомаркери на клетъчната смърт.