Елиз Ф. Соние

1 Bionovo Inc., Emeryville, Калифорния, Съединени американски щати,

обръщат

Омар И. Вивар

2 Катедра по хранителни науки и токсикология, Калифорнийски университет, Бъркли, Калифорния, Съединени американски щати,

Андреа Рубенщайн

1 Bionovo Inc., Emeryville, Калифорния, САЩ,

Сяоюе Жао

1 Bionovo Inc., Emeryville, Калифорния, Съединени американски щати,

Моше Олшански

3 Отдел по биоинформатика, Институт за медицински изследвания Уолтър и Елиза Хол, Парквил, Виктория, Австралия,

Скот Багет

1 Bionovo Inc., Emeryville, Калифорния, САЩ,

Ричард Е. Стауб

1 Bionovo Inc., Emeryville, Калифорния, Съединени американски щати,

Мери Таляфери

1 Bionovo Inc., Emeryville, Калифорния, Съединени американски щати,

Исак Коен

1 Bionovo Inc., Emeryville, Калифорния, САЩ,

Теренс П. Скорост

3 Отдел по биоинформатика, Институт за медицински изследвания Уолтър и Елиза Хол, Парквил, Виктория, Австралия,

4 Департамент по статистика, Калифорнийски университет, Бъркли, Калифорния, Съединени американски щати,

Джон Д. Бакстър

5 Център за диабет и звено за изследване на рака, Методисткият болничен изследователски институт, Хюстън, Тексас, Съединени американски щати,

Дейл С. Лайтман

2 Катедра по хранителни науки и токсикология, Калифорнийски университет, Бъркли, Калифорния, Съединени американски щати,

Замислени и проектирани експерименти: EFS DCL. Изпълнени експерименти: EFS OIV AR. Анализирани данни: EFS XZ MO TPS JDB DCL. Реактиви/материали/инструменти за анализ, допринесени: SB RES MT IC. Написа хартията: EFS JDB DCL.

Свързани данни

Резюме

Въведение

Менопаузата е свързана с дълбоко спадане на нивата на естрогени при жените. Това води до дефицит на естроген, който инициира ранни симптоми, включително горещи вълни, промени в настроението и вагинална сухота, и допринася за дългосрочни състояния като остеопороза и евентуално други хронични състояния, включително сърдечно-съдови заболявания, затлъстяване, диабет тип 2, метаболитен синдром и болестта на Алцхаймер болест. Жените в постменопауза често се лекуват с хормонална терапия в менопауза (MHT), съдържаща естрогени, които са много ефективни за предотвратяване на горещи вълни, урогенитална атрофия и остеопороза [1]. Проучването на женската здравна инициатива (WHI) [2], [3], проучването за заместване на сърцето и естрогена/прогестина [4] и здравното изследване на медицинските сестри [5] също установи, че MHT намалява риска от диабет тип 2. Други изследвания показват, че MHT намалява наддаването на тегло [6], [7] и предотвратява преразпределението на мазнините в коремната кухина [8], [9]. Въпреки тези важни ползи WHI демонстрира, че MHT увеличава риска от рак на гърдата, кръвни съсиреци и сърдечно-съдови заболявания [1], [10]. Макар и противоречиви, потенциалните неблагоприятни ефекти на естрогените доведоха до голям спад в употребата на MHT [11] и интензивен стремеж към разработване на по-безопасни естрогени в MHT за дългосрочна терапия.

Естрогените в MHT са въведени много години преди изясняването на факторите, участващи в сигнализирането на естрогенните рецептори. Основните открития включват идентифициране на два подтипа на естрогенните рецептори, множество класове ДНК регулаторни елементи, към които естрогенните рецептори се свързват в гените, както и множество протеини на корегулатора и транскрипционни фактори, които взаимодействат с ERs, за да променят структурата на хроматина за регулиране на генната транскрипция [12]. Тези вълнуващи открития могат да направят възможно разработването на естрогенни миметици, които са по-селективни и не изискват добавяне на прогестини, които изострят неблагоприятните ефекти на естрогените върху клетките на гърдата [13].

Една от стратегиите за използване на полезните метаболитни ефекти на ERα е да се идентифицират селективни ERα лекарства, които действат като агонисти в мастната тъкан, но не и в млечната жлеза (MG) или матката. Масивни усилия са насочени към идентифициране на естрогени с по-голяма селективност. Те са използвали широкомащабни скрининги с висока производителност, рентгенови кристалографски подходи и други методи. Освен неселективните естрогени, единственият друг клас естрогенни лекарства, налични за жени в менопауза, са селективните модулатори на естрогенните рецептори (SERM), като ралоксифен, които притежават смесена агонистична/антагонистична активност [36]. Много растения съдържат фитоестрогени, които подобно на естрадиола трансактивират естрогенните рецептори. Някои фитоестрогени проявяват селективност за ER подтипове [37]. Поради това търсихме съединения в растения, които са дали много фармацевтични продукти и са популярни сред жените [38], за да открием естрогени, които могат да проявят специфични за тъканите ефекти, които биха могли да предотвратят метаболитни усложнения по време на менопаузата. Тук ние докладваме за откриването на растителни екстракти, които имат естрогенна активност и обратно увеличаване на теглото и натрупване на мазнини, без да предизвикват неблагоприятни ефекти върху млечната жлеза или матката при мишки.

Материали и методи

Растителни екстракти

Изготвяне на RG

Пет килограма смлени, сушени корени от Glycyrrhiza uralensis Fischer или Glycyrrhiza glabra L .; (Fabaceae) се екстрахира два пъти с 25 литра 8∶2 етанол - вода в продължение на 8 часа и една нощ при стайна температура при постоянно разбъркване. Екстрактът се филтрира под вакуум през филтърна хартия Whatman # 4 и комбинираните филтрати се концентрират при понижено налягане при 50 ° С до приблизително 2 литра за отстраняване на етанола. Водната фракция беше лиофилизирана, за да се получи стабилен прах, който може да се разреди до определена концентрация за тестване.

Изготвяне на RP

Пет килограма смлени, сушени корени от Pueraria montana (Lour.) Merr. вар. lobata (Willd.) Maesen & S. Almeida (Fabaceae) се екстрахира два пъти с 25 литра 8∶2 етанол - вода в продължение на 8 часа и една нощ при стайна температура при постоянно разбъркване. Екстрактът се филтрира под вакуум през филтърна хартия Whatman # 4 и комбинираните филтрати се концентрират при понижено налягане при 50 ° С до приблизително 2 литра за отстраняване на етанола. Добавя се вода за увеличаване на обема до 4 литра и водната фракция се разпределя четири пъти с еднакъв обем (4 L) етилацетат. Етилацетатните слоеве се комбинират и се концентрират до сухо при понижено налягане. Останалите твърди вещества се суспендират отново от колбата с кръгло дъно с комбинация от вода и етанол и разтворът се суши чрез лиофилизация, за да се получи стабилен прах, който може да се разреди до определена концентрация за изпитване.

Анализи на клетъчна култура, трансфекция и луцифераза

Човешки U2OS остеосарком, MCF-7 рак на гърдата и ECC-1 клетъчни линии на рак на ендометриума са получени от American Type Culture Collection (Manassas, VA). U2OS клетки, експресиращи доксициклин-индуцируема ERα cDNA, са описани по-рано [39]. Всички клетъчни линии се поддържат и субкултивират, както е описано по-горе [40]. Трансфекциите се извършват с Bio-Rad генен пулсер, както е описано по-рано [40]. Накратко, U2OS клетките се електропорират с 3 ug ERE и NKG2E tk-Luciferase (tk-Luc) репортерен вектор и 1 ug експресионен вектор за ERα. ECC-1 клетките се електропорират с 3 ug ERE tk-Luc. След електропорация клетките се посяват и обработват с Е2, RG или RP в продължение на 18 часа. След това клетките се солюбилизират и луциферазната активност се определя с пробен комплект (Promega, Madison, WI). Експериментите бяха проведени най-малко три пъти и средната стойност ± S.E.M. беше изчислена.

Анализ на свързване на ERα

Свързването с ERα се определя чрез използване на базирани на флуоресцентна поляризация ER конкурентни анализи съгласно протокола на производителя (Invitrogen, Carlsbad, CA). Комплексът 2X Fluormone ™ ES2/ERα беше добавен към серия от разреждания на RG и RP, за да се генерират криви на конкуренция. Поляризацията е начертана спрямо концентрацията на RG и RP. Концентрацията на RG и RP, която води до половин максимално изместване на поляризацията, е равна на IC50.

Изследвания на ксенографт при голи мишки

MCF-7 клетките се отглеждат в DMEM/F-12 среда, съдържаща 4% отстранен фетален говежди серум и се суспендират отново в стерилен PBS∶Matrigel (1∶1). MCF7 клетки (250 000 клетки) се инжектират в мастната подложка на млечната жлеза (MG # 4; от двете страни) на 8-седмични голи CD-1 мишки (Charles River, Wilmington, MA). Мишките бяха разделени на случаен принцип в десет групи. Контролните мишки бяха третирани с носител. Лекуваните с Е2 мишки получават подкожна мини-помпа (Alzet, Cupertino, СА), съдържаща 0,25 mg Е2. Осем групи са лекувани орално, всеки ден, пет пъти седмично в продължение на 4 седмици с 40, 80, 160 или 320 mg/ден RG или RP поотделно. Размерът на тумора е измерен след 4 седмици. Всички протоколи за животни са одобрени от институционалния комитет по грижа и употреба на животните в Бионово. Всички експерименти с животни бяха проведени в строго съответствие с препоръките в Ръководството за грижа и употреба на лабораторни животни от Националния здравен институт.

Изследвания на теглото при мишки

Двадесет и 10 седмични женски мишки на яйчници C57Bl/6 (лаборатория Jackson, Bar Harbor, ME) са хранени с диета с високо съдържание на мазнини (Research Diets, Inc., New Brunswick, NJ) в продължение на 7 седмици, за да се увеличи телесното тегло. След напълняване мишките бяха разделени на случаен принцип в четири групи от пет мишки. Две групи са лекувани орално, пет пъти седмично в продължение на 6 седмици с 80 mg RG или RP, като същевременно се поддържат на HFD. Контролните мишки бяха третирани с непрекъсната инфузия, използвайки осмотични помпи Alzet, съдържащи носител. Третираните с Е2 мишки получиха помпи, съдържащи 0,25 mg Е2 в носител. Телесното тегло се записва седмично. В края на експеримента бяха събрани и претеглени млечни жлези # 4. Едната жлеза от всяка двойка беше подготвена за цели монтажи, а другата за хистология и екстракция на РНК. Депата на коремните мазнини също бяха събрани, претеглени и извлечени за РНК. Накрая матката беше събрана и претеглена и използвана за екстракция на РНК. Експериментът е възпроизведен и дава подобни резултати. Представените данни са представителни и за двата експеримента.

Цели монтажи на млечната жлеза

Целите опори на млечната жлеза са приготвени, както е описано по-горе [41]. Накратко, # 4 млечните жлези бяха дисектирани далеч от подкожните тъкани и фиксирани в прясно приготвен разтвор на Метакорн (60% метанол, 30% хлороформ и 10% оцетна киселина) в продължение на 48 часа, дехидратирани, обезмаслени с ацетон за 48 часа, рехидратирани и оцветени с железен хематоксилин за 2 часа преди измиване и консервиране на Histo-Clear (National Diagnostics, Somerville, NJ), както е описано [41]. Целите опори на млечната жлеза бяха изследвани чрез светлинна микроскопия за оценка на структурите на млечната жлеза.

Микрочипове

Коремната мазнина, млечните жлези # 4 и маточните тъкани от мишките, описани по-горе, бяха събрани в RNAlater RNA Stabilization Reagent (Qiagen). Общата РНК беше изолирана с Aurum total RNA мастна и влакнеста тъкан (Bio-Rad, Hercules, CA) съгласно протокола на производителя. Първоначално РНК беше количествено определена чрез стандартна спектрофотометрия и след това качествено оценена чрез капилярна електрофореза, използвайки системата Experion (Bio-Rad, Hercules, CA). Белязани с биотин кРНК проби се приготвят с 400 ng обща РНК матрица. След синтез и пречистване, белязаните с биотин проби се оценяват както с абсорбционна спектрофотометрия 260/280, така и с капилярна електрофореза. Окончателно белязаните cRNA проби бяха хибридизирани за една нощ срещу масиви MouseWG-6 BeadChip, съдържащи повече от 45 200 сонди (Illumina) от Калифорнийския университет, Сан Франциско Genomics Core.

Данните за интензивността на суровината се преобразуват в текстови файлове от софтуерния пакет Illumina BeadStudio и след това се анализират с помощта на Limma пакета BioConductor. По-специално, данните са коригирани на фона от нормален + експоненциален модел, като се използват отрицателни контроли и след това се нормализира квантилът. Линейният модел беше пригоден от лими и p-стойностите бяха изчислени въз основа на модериран t-тест и коригирани за многократно тестване чрез прилагане на корекцията на Benjamini-Hochberg. Гени с коригирани р-стойности 5′-CCCAGAGAGTATATAAGGACAAGCAAAGG-3 ′; Реверс 5′-AGTATGCCATTCCCCATTAATCTTTTCTAC-3 ′; GPX3 напред 5′-GTGAGCGCGATGGCCGTGTA-3 ′; Реверс 5′-ACCACAGACGGGCTCAGGGG-3 ′; LCN2 Напред 5′-TGGGGTCCTGCAGAGCCAGG-3 ′; Реверс 5′-CCTGCCCCGGAACTGATCGC-3 ′; CD8B напред 5′-ACTTCTGCGCGACGGTTGGG-3 ′; Реверс 5′-GGGTGGGGGAACGGGCATTG-3 ′; CD79B Напред 5′-GGAGACAAGCTGCAGCCCAGG-3 ′; Реверс 5′-CAACAGCCAGTGGCAGGGCA-3 ′; LEP напред 5′-GAGCACAAGGAGGGGCCAGC-3 ′; Обратен 5′-CGCAGCGAAGCGTGTACCCA-3 ′.

Резултати

Растителните екстракти активират транскрипцията чрез ERα

Осемнадесет растителни екстракта (PE), използвани в миналото за лечение на състояния, свързани с менопаузата [43], бяха скринирани за ERα активност чрез трансфекция на U2OS клетки с класически реагиращ на естроген елемент (ERE) нагоре по веригата на минималния тимидин киназен промотор, свързан с луциферазния репортерен ген (ERE) tk-Luc) и експресионен вектор за човешки ERα. Въз основа на тези екрани избрахме PE от Radix Glycyrrhiza uralensis (RG) и Radix Pueraria montana var. lobata (RP) за по-нататъшни проучвания, тъй като те показват ERα-медиирано активиране на ERE tk-Luc.

В допълнение към класическия ERE, ERα активността на RG и RP беше изследвана с помощта на по-сложен ERα реагиращ регулаторен елемент, получен от промотора на NKG2E, който изисква сътрудничество между c-jun, фактор на топлинен шок 2 и CCAAT/свързващо свързване протеин бета и вариант ERE за пълно активиране от E2 [44]. RG и RP са по-малко активни от E2 в U2OS остеосаркомни клетки, трансфектирани с експресионен вектор за ERα [39], но те произвеждат значително активиране на ERE (фиг. 1А) и NKG2E (фиг. 1В) tk-Luc репортери. Тези данни показват, че RG и RP имат ERα активност с различни видове елементи на естрогенен отговор.