Пълен текст

Цитати

Свързани статии

BioEntities

Външни връзки

Тобиас Л. Фрейтаг

1 Celiac Center, Div. по гастроентерология, Beth Israel Deaconess Medical Center, Harvard Medical School, 330 Brookline Avenue, Бостън, Масачузетс 02215

тънките черва

2 катедра по бактериология и имунология, Институт Хаартман, Хаартманинкату 3, 00014 Университет в Хелзинки, Финландия

Svend Rietdijk

3 Div. по имунология, Beth Israel Deaconess Medical Center, Harvard Medical School, 77 Avenue Louis Pasteur, Boston, MA 02215

Ивон Юнкер

1 Celiac Center, Div. по гастроентерология, Beth Israel Deaconess Medical Center, Harvard Medical School, 330 Brookline Avenue, Бостън, Масачузетс 02215

Юрий Попов

1 Celiac Center, Div. по гастроентерология, Beth Israel Deaconess Medical Center, Harvard Medical School, 330 Brookline Avenue, Бостън, Масачузетс 02215

Атул К. Бхан

4 Имунопатологично отделение, Масачузетска болница, Харвардско медицинско училище, 55 Fruit Street, Бостън, Масачузетс 02114

Киаран П. Кели

1 Celiac Center, Div. по гастроентерология, Beth Israel Deaconess Medical Center, Harvard Medical School, 330 Brookline Avenue, Бостън, Масачузетс 02215

Кокс Терхорст

3 Div. по имунология, Beth Israel Deaconess Medical Center, Harvard Medical School, 77 Avenue Louis Pasteur, Boston, MA 02215

Детлеф Шупан

1 Celiac Center, Div. по гастроентерология, Beth Israel Deaconess Medical Center, Harvard Medical School, 330 Brookline Avenue, Бостън, Масачузетс 02215

Свързани данни

Резюме

Предистория и цели

Целиакията (cd) е често срещано възпалително разстройство на тънките черва, което е резултат от нарушение на чревната толерантност към диетичните глутенови протеини, задвижвано от глутен-реактивни ефекторни Т-клетки. Целяхме да оценим патогенната роля на глутенореактивните ефекторни Т клетки и да генерираме модел на индуцирана от глутен ентеропатия.

Методи

CD4 + CD25− Т клетъчните фракции са прехвърлени по лимфопенични мишки, което води до „изходно“ възпаление на тънките черва.

Резултати

Rag1 -/- получатели на пресенсибилизирани към глиадин CD4 + CD45RBlowCD25− T клетки, но не и CD4 + CD45RB Високи наивни Т клетки, натрупаха по-малко тегло и страдаха от по-тежък дуоденит, когато бяха предизвикани с перорален глутен, отколкото получатели на безглутенова диета или получатели на контролни (овалбумин) предчувствителни Т клетки. Това беше придружено от влошаване на хистологичните характеристики на лигавицата, характерни за cd, и повишена поляризация на Th1/Th17 клетки в дванадесетопръстника и периферията. Интересното е, че повторното въвеждане на диета без глутен доведе до увеличаване на теглото, подобряване на хистологичния дуоденит и намаляване на дуоденалните IFNγ и IL-17 транскрипти. Нещо повече, B-клетъчно компетентни голи реципиенти на глиадин-пресенсибилизирани Т-клетки произвеждат високи нива на серумен анти-глиадин IgA и IgG1/IgG2c само когато се предизвикват с орален глутен.

Заключения

CD4 + Т-клетъчният имунитет към глутен води до нарушаване на оралния толеранс към глутен и патология на тънките черва при лимфопенични мишки, подобно на човешкия cd. Този модел ще бъде полезен за изследване на cd патогенезата, но също така и за тестване на нови недиетични терапии за cd.

Въведение

Целиакия (cd) е чувствителна към глутен ентеропатия, която има разпространение от 0,5–1% в повечето западни популации 1,2. 90–95% от пациентите носят човешкия левкоцитен антиген (HLA-) DQ2, а останалите HLA-DQ8 3. Cd се предизвиква от излагане на орален глутен (съхраняващите протеини на пшеница и сродни зърнени култури) и се характеризира с нарушена регулация на специфичните за глутена отговори на Т-клетките. Представянето на глутенови пептиди върху свързаните с cd молекули HLA клас II води до активиране на глутен-специфични CD4 + T помощни клетки 1 (Th1), които участват в задвижването на адаптивния имунен отговор, причиняващ чревна патология 3,4. Тънкочревните лезии в cd се определят от лигавична инфилтрация с лимфоцити, хиперплазия на криптите и атрофия на вили 1 .

Методи

Животни и лечение

Мъжки мишки донори C57BL/6 се поддържат на стандартизирана диета без глутен (AIN-76A, Research Diets) от раждането. Мишките бяха имунизирани в основата на опашката на ден -28 (100 μg антиген в CFA) и ден -14 (50 μg антиген в IFA) с глиадин или овалбумин (всички Sigma) и се жертваха на ден 1. Rag1 -/- (Jackson Laboratory) и голи (Taconic) реципиентни мишки (всички от генетичен произход C57BL/6) бяха държани в автоклавирани клетки и променени на облъчени AIN-76A на ден -7. На 1-ви ден, групи от съответстващи на теглото мъжки Rag1 -/- (на възраст 7–9 седмици) или мъже голи (8–24 седмици) реципиентни мишки се инжектират интраперитонеално с 4,5 × 10 5 фракционирани Т-клетки на донора на далак 9, 10. Някои групи получатели бяха променени на персонализирана, облъчена диета (базирана на AIN-76A, Research Diets), съдържаща 2,5 g пшеничен глутен (Sigma) на кг. След жертвоприношението се събира кръв и се вземат проби от тънките черва, дебелото черво, панкреаса, белия дроб, черния дроб, бъбреците и кожата за хистология. Одобрението за всички процедури е получено от институционалната комисия за грижи и употреба на животните (Протокол № 043-2005).

Подготовка на Т клетъчни фракции за експерименти с адоптивен трансфер

Не-Т клетките бяха изчерпани от донорни суспензии на спленоцити, използвайки колони за обогатяване на CD3 + Т клетки (R&D). CD4 + CD45RBlowCD25-, CD4 + CD45RBlowCD25 + или CD4 + CD45RBhigh Т клетки бяха избрани чрез поточна цитометрия 9,10, използвайки FACSAria Sorter (BD Biosciences). PE антимиши CD45RB, PE-Cy5 антимиши CD4 и FITC антимиши CD25 (всички BD Biosciences) бяха използвани за флуоресцентно маркиране. Клетъчните фракции са> 97% чисти при анализ след сортиране.

Клинични и макроскопични наблюдения и резултати

При аутопсия беше записано теглото на цялото тънко черво. Активността на колит се оценява клинично/макроскопски, като се изчислява сумата от 4 параметъра: Гъвкавост (0–1), загуба (0–1), удебеляване на дебелото черво (леко, умерено, тежко; 0–3), консистенция на изпражненията (нормална, мека, не оформен, воден; 0–3); максимален резултат = 8.

Хистологични анализи и резултати; имунохистохимия

Цитокин ELISA

Спленоцитите от отделни мишки бяха рестимулирани с 3 μg/ml anti-CD3 mAb (положителен контрол, клон 145-2C11, eBioscience), 10 μg/ml глиадин или 10 μg/ml овалбумин (отрицателна контрола; и двете от Sigma) в пълен RPMI 1640. Концентрациите на цитокини (pg/ml) се измерват в супернатантите след 48 часа, като се използват IFNy, IL-2, IL-4 и IL-10 ELISA комплекти (R&D, eBioscience). За статистически сравнения концентрациите на цитокини в отделни проби, стимулирани с глиадин или овалбумин (отрицателна контрола), са посочени към вътрешния стандарт за максимална стимулация (анти-CD3 mAb-активирани спленоцити на същата мишка).

Количествена RT-PCR

Проби от тънките черва (0,5 cm сегмент, 2 cm дистално от пилора) бяха събрани при умъртвяване и бързо замразени за по-нататъшен анализ. Относителните нива на транскрипт на иРНК бяха количествено определени с помощта на комплекта LightCycler FastStart DNA Master Hybridization Probes на LightCycler (всички от Roche), прилагайки принципа TaqMan, както е описано по-горе 16. Сондите TaqMan и наборите от праймери са показани в допълнителна таблица I. Нивата на транскрипта на mRNA са количествено определени, като се използват втори производни максимуми и вътрешни калибрационни криви, нормализирани до глицералдехид 3-фосфат дехидрогеназа (GAPDH) mRNA и изразени или в произволни единици като относителни промени (x-кратно) ) над средства за здрави контроли от C57BL6 или като съотношения.

Определяне на серумни антитела към глиадин и тъканна трансглутаминаза

Както е описано по-рано 17, 96-ямкови плаки са покрити за ELISA с 1 ug gliadin (Sigma) или рекомбинантна миша тъканна трансглутаминаза (tTG) на гнездо. Серумите се изследват в серийни разреждания. Антимиши IgA, IgG (и двете Sigma), IgG1 (Serotec) или IgG2c (Bethyl Lab; разреждания 1: 10 000–1: 100 000), маркирани с пероксидаза от хрян, са последвани от тетраметилбензидинов субстрат (Sigma) и откриване при 450 nm. бяха изчислени по формулата: (OD на проба - OD на празна проба) × серумно разреждане. Титрите под 20 се считат за отрицателни.

Статистически анализ

Данните бяха анализирани със софтуера Prism 5 (GraphPad). За данни за телесно тегло, р стойности (* р 18 (фиг. 1а). Поразително е, че Rag1 -/- мишки, които са получили осиновителни трансфериращи Т клетки от чувствителни на глиадин донори и са били предизвикани от глутен (група глиадин/глутен), са спечелили по-малко тегло от мишки, поддържани на gfd (глиадин/gfd), или от мишки, които са били предизвикани с орален глутен, но са получили осиновителни трансфери от контролно имунизирани донори (овалбумин/глутен; (фиг. 1б)). Това предполага, че глиадин-грундиране на донорни Т клетки доведоха до обостряне на чревно възпалително заболяване при Rag1 -/- реципиенти, предизвикани с орален глутен.

Въвеждането на gfd води до обръщане на индуцирани от глутен възпалителни промени в Rag1 -/- реципиенти на глиадин-пресенсибилизирани Т клетки

а) Промени в телесното тегло на Rag1 -/- мишки в продължение на 21,5 седмици след прехвърляне на предчувствителни към глиадин CD4 + CD45RBlowCD25− T клетки. Веднага след въвеждането на gfd на седмица 10.5 (↑), групата за преминаване към диета набира тегло в сравнение с групата на глиадин/глутен (*** p +++ p 9,20. Важното е, че и двете групи получатели не се различават по някой от следните параметри: телесно тегло, индекс на активност при колит, хистология на тънките и дебелите черва и секреция на цитокини от спленоцити, рестимулирани in vitro (данните не са показани). В заключение, глиадин грундиране на донорски мишки и избор на CD4 + CD45RBlowCD25− памет Т клетките за адоптивен трансфер са от решаващо значение за индуцирането на чувствителна към глутен ентеропатия.

Голи мишки, предизвикани с орален глутен, след приемане на транссенсибилизирани глиадин Т-клетки произвеждат серумни глиадинови антитела

Серумните нива на анти-глиадин IgA и IgG бяха определени при 2 групи голи реципиенти на мишки (глиадин/глутен, глиадин/gfd), както и при контролни мишки C57BL/6, отгледани на безглутенова диета (C57BL/6-gfd ) или нормална (съдържаща глутен) чау (C57BL/6-глутен; всяка n = 8). Разликите за анти-глиадиновите IgG и IgA между глиадин/глутен и всяка друга група бяха много значими (*** р 9,20 само при реципиенти, предизвикани с орален глутен, но не и при мишки, държани на gfd. Глютеновата специфичност беше допълнително демонстрирана поради липса на ефект при реципиенти на наивни Т-клетки или Т-клетки на паметта, предварително сенсибилизирани с неподходящ хранителен антиген, и най-важното, чрез обръщане на загуба на тегло, подобряване на ентеропатията и нормализиране на имунологичните промени след преминаване към gfd. Възпалителни промени, предизвикани от глутен в хистологията на тънките черва са свързани с повишена поляризация на Th1 (и Th17) в дванадесетопръстника, имитирайки отблизо цитокиновите модели в лигавицата на пациенти с активен cd 4,19. Производството на високи серумни анти-глиадинови IgA и IgG титри (включително Th1 -свързан IgG2c подклас) при голи реципиенти допълнително демонстрира нарушение на чревната толерантност към глутена в този модел.

Нарушаването на оралната толерантност към безвредни антигени, обикновено поддържано от чревни регулаторни Т-клетки, причинява автоимунно възпалително заболяване в червата 8-10. Съответно, регулаторните CD4 + CD25 + Т клетки (Treg) бяха изчерпани в нашия модел чрез FACS селекция на CD4 + CD45RBlowCD25-T клетки с имунизиран с глиадин донори. Предишни доклади показват, че CD4 + CD45RBlowCD25− T клетки (но не CD4 + CD45RBlowCD25 + T клетки) от наивни донори могат да предизвикат загуба на болест при Rag2 -/- мишки 21 и да не потискат колит в CD4 + CD45RBhigh Т клетъчен модел на трансфер 22 . Нашите резултати, използващи CD4 + CD45RBlowCD25− Т клетки от негрундирани или контролирани имунизирани донори, потвърдиха присъщата патогенност на тази Т клетъчна фракция, водеща до ниско ниво на изходен дуоденит при Rag1 -/- мишки. Следователно предизвиканите от глутен специфични промени трябва да бъдат измерени спрямо възпалителен фон.

Проксималната патология на тънките черва в нашия модел наподобява дуоденит, наблюдаван след адоптивен трансфер на CD4 + CD45RBhigh Т клетки в лимфопенични мишки 9,20, като цяло се счита за модел на болестта на Crohn. Патологията се характеризира с инфилтрация на лигавицата с лимфоцити, хиперплазия на криптите и атрофия на вили, промени, които се считат за типични за cd, но също така и с инфилтрация с неутрофили, водещи до криптит и абсцеси на криптите. Докато абсцесите на криптите са нетипични за cd, инфилтрацията на неутрофили е характерна характеристика на чревните лезии на тънките черва 24,25. Наскоро профилирането на генна експресия в биопсични проби от пациенти с целиакия разкри хронично набиране на активирани неутрофили както при активно заболяване, така и при ремисия 26, което показва, че неутрофилите могат да осигурят (ранни) вродени имунни сигнали за развитие на cd 2,27. Интересното е, че голите мишки бяха частично защитени от дуоденит в сравнение с Rag1 -/- реципиенти, подобно на частичната защита от колит, наблюдаван при B-компетентни срещу некомпетентни TCRα -/- мишки 23, ефект, който вероятно се дължи на регулаторната функция на B-клетките.

Що се отнася до адаптивния имунитет, cd се характеризира с нарушена регулация на специфичните за глутен отговори на Т-клетките. Целиакичният автоантиген tTG може да дезаминира определени глутаминови остатъци от погълнатите глутенови пептиди (главно глиадини) 17 и тези модифицирани глиадинови пептиди се свързват с повишен афинитет само към молекулите HLA-DQ2 и -DQ8 върху антиген-представящите клетки 1,3. Резултатът е активиране на специфични за глиадин CD4 + Th1 клетки, привидно непроверени от регулаторните Т клетки. Водейки до подобен резултат, нашият модел се основава на приемния трансфер на CD4 + CD45RBlowCD25− Т клетки от мишки, имунизирани с глиадин в CFA, експресиращ миши MHC H2b хаплотип. Следователно липсват компонентите на HLA-DQ2- или -DQ8-ограничено (дезамидирано) представяне на глутенов пептид и автоимунитет към tTG. Независимо от това, моделът може да бъде допълнително усъвършенстван чрез въвеждане на cd-свързани HLA клас II трансгени.

Храненето с разтворим антиген на наивни мишки води до индуциране на антиген-специфичен, толерогенен Treg 28,29, който потиска възпалителните реакции в стомашно-чревния тракт 29. Към днешна дата само едно проучване съобщава за индуциране на Т-клетъчно медиирана ентеропатия чрез хранене на разтворим антиген 30, резултат от блокада на метаболити на имуномодулираща арахидонова киселина, напр. простагландин Е2. Съответно, както изчерпването на толерогенния Treg, така и осигуряването от вродената имунна система на костимулиращи възпалителни сигнали вероятно са необходими за активиране на глиадин-специфични Т-клетки на паметта и последващо глутензависимо обостряне на дуоденит в нашия модел. По-нататък първото се предполага от наблюдението, че нефракционираните Т клетки не водят до чревно възпаление, подобно на CD4 + CD45RBhigh трансферен модел 9,10 .

Дозата за хранене от

12,5 mg глутен/мишка/ден съответства на 2,7 пъти средния прием на глутен, коригиран с телесно тегло при хора, изчислен при

13g глутен/човек/ден за Западна Европа 31. При наивни животни поглъщането на толкова големи количества хранителен протеин би довело до орална поносимост, както е показано при здрави или колитични мишки (CD4 + CD45RBhigh модел) 29,32, които са били хранени със специфичен хранителен протеин (овалбумин), предизвиквайки производството на регулаторни цитокини TGFβ1 и IL-10 и потискане на Th1 клетките. В явен контраст, нашата стратегия за селективен трансфер на глиадин-грундирани Т-клетки доведе до отмяна на толерантността към хранителния глутен и повишена дуоденална патология, характеризираща се с свръхекспресия на IFNγ и IL-17. Производството както на IFNγ, така и на IL-17 от CD4 + Т клетки наскоро беше съобщено в миши gvhd 33. Относителното увеличение на TGFβ1 и IL-10 спрямо нивата на транскрипт на IFNγ при получатели на Rag1 -/- при 21,5 срещу 8,5 седмици и изразените увеличения съответно на IL-17 и IL-2, може да показват повишена регулация на ефекторните Т-клетъчни отговори и евентуално преминаване от Th1 към Th17 производство на цитокини по време на хронифициране на дуоденит в нашия модел.

В заключение представяме малък животински модел на индуцирана от глутен ентеропатия, наподобяващ човешки cd. Предлагаме този модел да се използва за изследване на механизмите на орална толерантност и cd патогенеза, но също така и за тестване на недиетични терапии на cd, които имат за цел разграждането, неутрализацията или изключването на лигавицата на глутен след поглъщане. Това е важно, тъй като 1) стандартната терапия, строга безглутенова диета, е трудна за поддържане и 2) скритите следи от глутен в храната представляват постоянен хранителен риск за пациентите с целиакия. Терапевтични подходи като перорални ензимни терапии 34,35 или инхибиране на усвояването на чревния глутен 36 напоследък привличат вниманието. Тестването на тяхната приложимост и ефикасност трябва да бъде осъществимо в този нов животински модел.

Допълнителен материал

suppl файл с данни

Благодарности

Благодарим на Джон Дейли и Сюзън Лазо-Каланян (институт за рак на Дана Фарбър, Бостън, Масачузетс) за техническа подкрепа при сортиране на клетки, Джесика Закс и Аниша Ю. Шарма за извършване на RT-PCR и Сюзан Уайт, Уенди Дасгупта и Джъстин Коен (всички Бет Израелски медицински център за дяконеса, Бостън, Масачузетс) за помощ при хистология и имунохистохимия. Благодарни сме на д-р Даниеле Сблатеро (Университет в Източен Пиемонт, Новара, Италия) за предоставянето на рекомбинантна мишка tTG.

Финансиране:

Тази работа беше подкрепена от безвъзмездната помощ на NIH №1 R21 DKO73254-01 на Detlef Schuppan.