Отделение по онкология и неврология, „Г. D'Annunzio ”University, Chieti, Италия

Лаборатория по имунопатология, Катедра по съдова медицина и фармакология, Консорцио Марио Негри Суд, Санта Мария Имбаро, Киети, Италия

Лаборатория по имунопатология, Consorzio Mario Negri Sud, Via Nazionale, I ‐ 66030 Санта Мария Имбаро, Киети, Италия. Факс: +39 872 578240 Потърсете още статии от този автор

Лаборатория по туморна и съдова клетъчна биология, Катедра по съдова медицина и фармакология, Консорцио Марио Негри Суд, Санта Мария Имбаро, Киети, Италия

Лаборатория по туморна и съдова клетъчна биология, Катедра по съдова медицина и фармакология, Консорцио Марио Негри Суд, Санта Мария Имбаро, Киети, Италия

Катедра по хистология, Католически университет, Рим, Италия

Катедра по имунология, Институт Реджина Елена, Рим, Италия

Отделение по онкология и неврология, „Г. D'Annunzio ”University, Chieti, Италия

Лаборатория по имунопатология, Катедра по съдова медицина и фармакология, Консорцио Марио Негри Суд, Санта Мария Имбаро, Киети, Италия

Отделение по онкология и неврология, „Г. D'Annunzio ”University, Chieti, Италия

Лаборатория по имунопатология, Катедра по съдова медицина и фармакология, Консорцио Марио Негри Суд, Санта Мария Имбаро, Киети, Италия

Отделение по онкология и неврология, „Г. D'Annunzio ”University, Chieti, Италия

Отделение по онкология и неврология, „Г. D'Annunzio ”University, Chieti, Италия

Лаборатория по имунопатология, Катедра по съдова медицина и фармакология, Консорцио Марио Негри Суд, Санта Мария Имбаро, Киети, Италия

Лаборатория по имунопатология, Consorzio Mario Negri Sud, Via Nazionale, I ‐ 66030 Санта Мария Имбаро, Киети, Италия. Факс: +39 872 578240 Потърсете още статии от този автор

Лаборатория по туморна и съдова клетъчна биология, Катедра по съдова медицина и фармакология, Консорцио Марио Негри Суд, Санта Мария Имбаро, Киети, Италия

Лаборатория по туморна и съдова клетъчна биология, Катедра по съдова медицина и фармакология, Консорцио Марио Негри Суд, Санта Мария Имбаро, Киети, Италия

Катедра по хистология, Католически университет, Рим, Италия

Катедра по имунология, Институт Реджина Елена, Рим, Италия

Отделение по онкология и неврология, „Г. D'Annunzio ”University, Chieti, Италия

Лаборатория по имунопатология, Катедра по съдова медицина и фармакология, Консорцио Марио Негри Суд, Санта Мария Имбаро, Киети, Италия

Отделение по онкология и неврология, „Г. D'Annunzio ”University, Chieti, Италия

Лаборатория по имунопатология, Катедра по съдова медицина и фармакология, Консорцио Марио Негри Суд, Санта Мария Имбаро, Киети, Италия

Отделение по онкология и неврология, „Г. D'Annunzio ”University, Chieti, Италия

Резюме

МАТЕРИАЛИ И МЕТОДИ

Клетки

Клетъчната линия B16-BL6 е вариант на миши меланом, силно метастатичен в белите дробове на сингенни мишки C57BL/6N (Talmadge и Fidler, 1982), избрани от родителската клетъчна линия B16 (Hart, 1979). Туморните клетки се отглеждат като монослоеве в DMEM (GIBCO, Paisley, UK), допълнени с 10% инактивиран с топлина FCS (GIBCO) и 2 mM глутамин. За инжектиране клетките се събират във фаза на растеж. Високоафинитетните места за свързване на естроген в клетки B16-BL6 бяха изследвани с помощта на метод с въглен, покрит с декстран. Освен това, наличието на естроген рецепторни протеини се изследва имунохистохимично от антитела срещу естроген рецептор (Neomarkers, Union City, CA) в цитоцентрифугирани препарати на B16-BL6 клетки. И двата метода не успяват да разкрият тези рецептори. Естроген-свързващите места от тип II се изследват по метода на хидроксиапатита, както е описано (Piantelli и др., 1995).

Наркотици и химикали

Кверцетин (3,3 ', 4', 5,7-пентахидроксифлавон), апигенин (4 ', 5,7-трихидроксифлавон), хесперидин (3', 5,3-хидрокси-4-метоксифлаванон), рутин (3-рамнозилглюкозид кверцетин), (-) - епигалокатехин-3-галат (EGCG; [2R, 3R] -2- [3,4,5-трихидроксифенил] -3,4-дихидро-1 [2Н] -бензопиран-3,5, 7-триол-3- [3,4,5-трихидроксибензоат]), ресвератрол (3,4 ′, 5-трихидрокси-трансСтстилбен), куркумин (1,7-бис [4-хидрокси-3-метоксифенил] -1,6-хептадиен-3,5-дион), тамоксифен (транс‐2 [4‐ (1,2-дифенил-1-бутенил) фенокси] -N, NДиметилетиламин) и цисплатин (цис‐Diamminedichloroplatinum) са получени от Sigma (Deisenhofen, Германия). Иприфлавон (изофлавон) е подарък от Chiesi (Парма, Италия).

Инвитро клетъчна пролиферация

Клетките се посяват при 10 4/cm 2 в 16 mm гнезда на 24-ямкови плочи (Falcon, Becton Dickinson, Oxnard, CA). След 18 часа средата беше заместена с прясна среда, съдържаща съединенията, които трябва да бъдат тествани. Всички съединения, с изключение на EGCG, бяха взети от абсолютен разтвор на етанол и контролните клетки бяха третирани със същото количество носител. Крайната концентрация на етанол не надвишава 0,5% (v/v), нито в контролните, нито в третираните проби. EGCG се разтваря в Н20. Леченията се повтарят след 24 часа. Четирикратно хемоцитометрично преброяване на трикратни култури се извършва след 72 часа излагане на съединенията. За проучванията за включване на тимидин клетките се посяват при 10 4/cm 2 в 96-ямкови микротитърни плаки (Falcon, Becton Dickinson) в 10% FCS среда. След 18 часа средата беше отстранена и клетките бяха поддържани в 0.2% FCS среда в продължение на 72 часа, за да предизвикат спиране на клетъчния цикъл. След това средата беше заменена с прясна 10% FCS среда, съдържаща съединенията за изпитване или носител, както е описано по-горе. Нивото на включване на тимидин се определя, както е описано по-горе (Caltagirone и др., 1997).

Анализ на растежа на тумора

Женски мишки C57BL/6N (на възраст от 6 до 8 седмици) са получени от Charles River (Calco, Италия). Във всеки експеримент животните бяха съпоставени по възраст и тегло. Туморни клетки (5 × 104), в 0,1 ml PBS, се инжектират i.m. в гастрокнемийния мускул на мишки, които са рандомизирани в експериментални групи от 6 до 8 животни, получаващи носител или ежедневно i.p. лечение в посочените дози. Кверцетин, апигенин, ресвератрол, куркумин и тамоксифен бяха суспендирани чрез обработка с ултразвук в PBS, съдържащ 20% полиетилен гликол (PEG 400) и 2% Tween-80 (pH 7.2) (Gerritsen и др., 1995). EGCG и цисплатин се разтварят в H2O. Лечението е започнало в деня на инжектиране на туморни клетки за всички съединения с изключение на цисплатин. Цисплатин е прилаган i.v. 3 дни след инжектиране на туморни клетки на интервали от 3 дни за общо 3 дози. Растежът на тумора се измерва 3 пъти седмично с дебеломер и обемът на тумора се изчислява по формулата дължина × ширина 2/2 (Giavazzi и др., 1986; Алесандри и др., 1987; Чириви и др., 1994). Средният обем на крака в деня на инжектиране на туморни клетки е 0,05 ± 0,01 cm 3. Всички животни бяха третирани в съответствие с насоките на Европейската общност.

Тест за колонизация на белите дробове

Мишките се инжектират с 5 х 104 туморни клетки в 0,1 ml PBS в страничната вена на опашката. Леченията се прилагат i.p. дневно, започвайки 1 час преди инжектиране на туморни клетки. Мишките бяха убити чрез цервикална дислокация 14 до 18 дни след инжектиране на туморни клетки. Белите дробове бяха фиксирани в разтвора на Bouin и колониите на черни туморни клетки бяха преброени от 2 различни оператора.

Анализ за разпределение на органи

Културите на клетки B16-BL6 бяха предварително маркирани с 5- [125 I] iodo-2'-дезоксиуридин (Amersham, Aylesbury, UK) при 0,3 mCi/ml за 24 часа. Белязани туморни клетки, при концентрация 5 х 104 в 0,1 ml PBS, се инжектират i.v. при мишки, получаващи превозно средство или i.p. лечение 1 час преди клетъчно инжектиране. На 10 минути и 2, 4, 8 и 24 часа след инжектиране на туморни клетки мишки бяха умъртвени и белите дробове отстранени и измити с 3 промени на 70% етанол. Радиоактивността в белите дробове, черния дроб, далака, бъбреците, кръвта и урината на пикочния мехур се определя с помощта на гама-брояч (Fidler, 1970)

Инвитро анализ за инвазия

Анализът на химиоинвазията е извършен, както е описано по-рано (Albini и др., 1987). Накратко, поликарбонатни филтри с диаметър 13 mm (без поливинилпиролидон, размер на порите 5 μm; Nucleopore, Pleasanton, CA), покрити с 15 μg/филтър от основната мембрана Matrigel (Becton Dickinson, Милано, Италия), бяха поставени в камерите за хемотаксис на Boyden. Клетки, суспендирани при концентрация 3 × 105/0,8 ml в DMEM, се добавят към горната камера със или без съединенията, които ще бъдат тествани. Долната камера съдържа 0,2 ml без серум кондиционирана среда, получена от 18 часа култури от 30 × 10 4 швейцарски 3T3 клетки, разредени 1: 2, като химио-атрактант. Бойденските камери се инкубират при 37 ° С в продължение на 6 часа; след това клетките на горната повърхност на филтрите бяха механично отстранени и филтрите фиксирани в метанол и оцветени с хематоксилин и еозин. Клетките, които са нахлули в долната повърхност на филтрите, са преброени под светлинен микроскоп върху 5 полета (увеличение × 400). Всяко състояние беше тествано в три екземпляра. Жизнеспособността на клетките B16-BL6 е по-голяма от 90%, както е оценено в паралелни култури чрез трипанско синьо оцветяване.

Статистически анализ

Ефектите от лечението върху интрамускулния растеж на тумора бяха оценени от ANOVA с повтарящи се мерки. Post hoc След това бяха направени сравнения с теста на Scheffe, при ниво на значимост от 5%, за да се сравни ефикасността на леченията. Двустранна ученическа тТестът за несдвоени сравнения е използван за оценка на значимостта на ефектите от леченията върху образуването на туморни колонии в белите дробове и върху инвазивната активност на B16-BL6.

РЕЗУЛТАТИ

Полифенолните съединения инхибират растежа на B16-BL6 меланомни клетки инвитро

The инвитро растежът на B16-BL6 меланомни клетки в присъствието на серия от полифенолни съединения (10-9 до 10-5 M) беше оценен. Кверцетин, апигенин, EGCG, ресвератрол, куркумин и тамоксифен инхибират растежа на B16-BL6 клетки в зависимост от концентрацията (Фиг. 1). Концентрациите, необходими за инхибиране на клетъчния растеж с 50% (IC50), са отчетени в Таблица I. За разлика от тях рутин, хесперидин и иприфлавон са неефективни (фиг. 1). Инхибиторният ефект на тамоксифен не може да бъде обърнат чрез добавяне на екзогенни естрогени (данните не са показани). В съгласие с това наблюдение открихме, че клетките B16-BL6 са отрицателни за естрогенните рецептори. Съединенията, които инхибират клетъчния растеж, също инхибират B16-BL6 ДНК синтеза, както е оценено чрез включване на тимидин, със стойности на IC50, подобни на наблюдаваните за намаляване на броя на клетките (данните не са показани).

флавоноидите

Полифенолните съединения инхибират растежа на B16-BL6 меланомни клетки инвитро. Клетките се посяват при 10 4/cm 2 в 16 mm гнезда на 24-ямкова плоча. След 18 часа средата беше заместена с прясна среда, съдържаща съединенията, които трябва да бъдат тествани. Леченията се повтарят след 24 часа. Четирикратно хемоцитометрично преброяване на трикратни култури се извършва след 72 часа излагане на съединенията. Контролната стойност беше 160 000 ± 10 000 клетки/ямка. Затворени триъгълници, кверцетин; отворени квадратчета, апигенин; затворени кръгове, куркумин; затворени квадрати, тамоксифен; обърнати отворени триъгълници, EGCG; затворени диаманти, ресвератрол; отворени триъгълници, иприфлавон; отворени кръгове, рутин; отворени диаманти, хесперидин. Резултатите от 3 експеримента, извършени в три екземпляра, са изразени като средни стойности ± SD.

Обработки IC50 (μM)
Апигенин 1.5
Кверцетин 3.5
EGCG 8.9
Тамоксифен 2.8
Куркумин 3.6
Ресвератрол 5.0
  • Резултатите са изразени като средно за 3 експеримента в три екземпляра. SD бяха

Полифенолните съединения инхибират растежа на B16-BL6 меланомни клетки in vivo

Полифенолните съединения инхибират растежа на B16-BL6 меланомни клетки in vivo. B16-BL6 клетки (5 × 104) се инжектират в мускула на гастрокнемия. Мишките бяха третирани i.p. всеки ден със съединенията, които ще бъдат тествани или носител (контрол). Резултатите са изразени като средни стойности ± SD (n = 8 мишки/група) и представляват 3 експеримента. а) Затворени кръгове, контрол; отворени квадрати, 25 mg/kg апигенин; отворени триъгълници, 50 mg/kg апигенин; затворени квадрати, 25 mg/kg кверцетин; затворени триъгълници, 50 mg/kg кверцетин. б) Затворени кръгове, контрол; отворени диаманти, 50 mg/kg ресвератрол; отворени квадрати, 50 mg/kg тамоксифен; отворени триъгълници, 50 mg/kg EGCG. ANOVA от данните показва, че както леченията, така и времето на лечение (дни) имат значителен ефект върху обема на тумора (стр апигенин = кверцетин = тамоксифен> ресвератрол> контрол.

Апигенинът увеличава инхибиторния ефект на цисплатина върху растежа на меланом B16-BL6 in vivo. Експериментът е извършен, както е описано на Фигура 2. Цисплатин е прилаган i.v. 3 дни след инжектиране на туморни клетки на интервали от 3 дни, за общо 3 дози. Резултатите са изразени като средна стойност ± SD (n = 8 мишки/група) и представляват 3 експеримента. Затворени кръгове, контрол; отворени квадрати, 25 mg/kg апигенин; отворени диаманти, 2 mg/kg цисплатин; отворени триъгълници, 25 mg/kg апигенин + 2 mg/kg цисплатин. ANOVA от данните показва, че както леченията, така и времето на лечение (дни) имат значителен ефект върху обема на тумора (стр

Кверцетинът и апигенинът силно инхибират белодробната колонизация на B16-BL6 клетки

Съединенията, които инхибират растежа на тумори B16-BL6, бяха тествани за способността им да инхибират колонизацията на белите дробове. Макроскопският външен вид на белите дробове от нелекувани и третирани мишки ясно показва, че 50 mg/kg кверцетин намалява броя на белодробните метастази след i.v. инжектиране на клетки B16-BL6 (фиг. 4). Когато количествено бяха оценени ефектите от леченията, открихме, че кверцетинът и апигенинът, както при 50, така и при 25 mg/kg, значително намаляват броя на колониите, докато тамоксифенът е ефективен само при най-високата доза (Таблица II). Освен това, във всеки от 3-те експеримента, показани в таблица 2, кверцетинът и апигенинът при 50 mg/kg са били значително по-ефективни от тамоксифен при същата доза (стр

Кверцетинът инхибира колонизацията на белите дробове на клетките B16-BL6. Клетки (5 × 104) се инжектират в страничната опашна вена на 6 мишки. Кверцетин е даван i.p. всеки ден при 50 mg/kg. Бели дробове от мишки, третирани с носител (горен ред) и кверцетин (долен ред). Мащабна лента = 1 cm.

Експериментален контрол Кверцетин (mg/kg) Апигенин (mg/kg) Тамоксифен (mg/kg) EGCG (mg/kg) Ресвератрол (mg/kg) 25 50 25 50 25 50 25 50 25 50 50
1 86 ± 192 2 Резултатите са изразени като средни стойности ± SD и% от контрола (в скоби).
65 ± 123 3 стр 29 ± 54 4 стр 61 ± 133 3 стр 34 ± 44 4 стр 73 ± 15 48 ± 104 4 стр 83 ± 18 85 ± 20 82 ± 19 74 ± 13
(100) (75) (34) (71) (40) (85) (56) (96) (99) (95) (86)
2 123 ± 19 93 ± 103 3 стр 42 ± 124 4 стр 91 ± 123 3 стр 43 ± 54 4 стр 105 ± 20 66 ± 94 4 стр 121 ± 13 117 ± 14 115 ± 12 110 ± 11
(100) (77) (34) (74) (35) (85) (54) (98) (95) (93) (89)
3 77 ± 16 61 ± 63 3 стр 30 ± 74 4 стр 58 ± 83 3 стр 34 ± 64 4 стр 66 ± 10 42 ± 74 4 стр 77 ± 18 72 ± 13 77 ± 15 76 ± 14
(100) (79) (39) (75) (44) (86) (54) (100) (93) (100) (99)
  • 1 Експериментите бяха проведени, както е описано на Фигура 4. Колониите бяха преброени от 2 различни оператора 14 дни след инжектиране на туморни клетки.
  • 2 Резултатите са изразени като средни стойности ± SD и% от контрола (в скоби).
  • 3 стр 4 стр

Кверцетинът и апигенинът силно инхибират инвазията на B16-BL6 клетки инвитро

Кверцетин, апигенин, EGCG, ресвератрол и тамоксифен (10–5 М) бяха изследвани за ефекта им върху инвазията на B16-BL6 клетки инвитро. Кверцетин, апигенин и тамоксифен, но не EGCG или ресвератрол, значително (стр

Кверцетин и апигенин инхибират инвазията на B16-BL6 клетки инвитро. B16-BL6 клетки (3 × 105) бяха добавени към горното отделение на камера на Бойдън със или без посочените съединения (10–5 М). Долната камера съдържа среда, допълнена с 50% швейцарски 3T3 супернатант, като химио-атрактант. След 6 часа клетките, които нахлуха в долната повърхност на филтрите, бяха преброени под светлинен микроскоп върху 5 полета (× 400). Резултатите от 4 експеримента, извършени в три екземпляра, са изразени като средни стойности ± SD. *стр