Митохондриални изследвания

Тази статия е част от изследователската тема

Роля на контрола на качеството на митохондриите в миокардната и микроваскуларната физиология и патофизиология Вижте всички 12 статии

Редактиран от
Хао Джоу

Обща болница на народната освободителна армия, Китай

Прегледан от
Ин Тан

Болница Nanfang, Южен медицински университет, Китай

Джин Уанг

Първа свързана болница на китайската PLA General Hospital, Китай

Ана Шмит

Университет на Западен щат Колорадо, САЩ

Принадлежностите на редактора и рецензенти са най-новите, предоставени в техните профили за проучване на Loop и може да не отразяват тяхното положение по време на прегледа.

ste20-подобна

  • Изтеглете статия
    • Изтеглете PDF
    • ReadCube
    • EPUB
    • XML (NLM)
    • Допълнителни
      Материал
  • Цитат за износ
    • EndNote
    • Референтен мениджър
    • Прост ТЕКСТ файл
    • BibTex
СПОДЕЛИ НА

Оригинални изследвания СТАТИЯ

  • 1 Катедра по кардиология, Асоциираната болница на медицинския колеж Chengde, Chengde, Китай
  • 2 Първият медицински отдел, градска болница по традиционна китайска медицина Chengde, Chengde, Китай

Въведение

Възпалението на миокарда е отличителен белег на няколко сърдечно-съдови нарушения, като миокарден инфаркт, миокардна исхемия-реперфузионно увреждане, диабетна кардиомиопатия и свързано със сепсис увреждане на миокарда (Gebhard et al., 2018; Zhong et al., 2019) Имунните клетки и провъзпалителните цитокини, участващи във възпалителния процес, насърчават кардиомиоцитната дисфункция, което допринася за прогресията на сърдечно-съдовите заболявания, тежестта и резултатите (Ziegler, 2005). Въпреки това, молекулярните механизми, лежащи в основата на медиираната от възпалението дисфункция на кардиомиоцитите, не са напълно изяснени.

Митохондриите играят централна роля в регулацията на жизнеспособността и функцията на кардиомиоцитите (Wider et al., 2018). Те са основният източник на производство на АТФ в кардиомиоцитите чрез окислително фосфорилиране и са от съществено значение за регулиране на контрактилитета на кардиомиоцитите (Santin et al., 2019). Освен това, повредените митохондрии предизвикват смърт на кардиомиоцитите чрез предизвикване на оксидативен стрес, изчерпване на АТФ, освобождаване на проапоптотични фактори и претоварване с калций (Wang et al., 2019; Antonucci et al., 2020). Съобщава се и за свързани с възпаление метаболитни промени в митохондриите. Pirrozzi et al. (2020) съобщават, че чернодробното възпаление причинява анормален метаболизъм на мастните киселини в митохондриите. Противовъзпалителните ефекти на омега-3 (DHA) при невродегенеративните заболявания се медиират от промени в митохондриалните функции (Braz-De-Melo et al., 2019). Свръхекспресията на SIRT3 насърчава митохондриалната функция и отслабва съдовото възпаление, ендотелната дисфункция, съдовата хипертрофия и ангиостеозата. Възпалението, свързано с увреждане на гръбначния мозък (SCI), се причинява от прекомерно производство на митохондриални реактивни кислородни видове (ROS). Връзката между митохондриалната дисфункция и свързаното с възпаление увреждане на кардиомиоцитите обаче досега не е изследвана.

Материали и методи

Клетъчна култура и лечение

Клетъчната линия на кардиомиоцитите H9C2 се култивира в среда на модифициран орел на Dulbecco (DMEM) (Nacalai Tesque Inc., Киото, Япония), съдържаща 10% FBS, 100 μg/ml стрептомицин и 100 U/ml пеницилин в овлажнена камера при 37 ° C в 5% CO2, както беше съобщено по-рано (Kim et al., 2019). Клетките H9C2 се активират, използвайки 10 μg/ml липополизахариди (LPS) в продължение на 24 часа. Активността на Mst2 се инхибира чрез инкубиране на H9C2 клетки с Mst2 инхибитор XMU-MP1 (Кат. № 6482, Bio-Techne China Co. Ltd.) за 6 часа.

Имунофлуоресцентно оцветяване

Третирани с LPS- или XMU-MP1 H9C2 клетки бяха фиксирани с 4% параформалдехид за 10 минути, измити със студен PBS три пъти и блокирани с 5% BSA в PBS върху лед за 30 минути. След това, клетките H9C2 бяха инкубирани една нощ при 4 ° С с първичното антитяло срещу TOM20 (1: 1,000, Abcam, # ab186735). След това, след трикратно измиване със студен PBS, клетките се оцветяват с Alexa Fluor-594 козе анти-мишо вторично антитяло в 1% BSA/PBS за 1 h при 4 ° C. След това клетките бяха проникнали с 0,5% сапонин в продължение на 15 минути при стайна температура, оцветени с DAPI и изображенията бяха заснети с помощта на конфокален микроскоп Nikon A1 (Wolint et al., 2019).

Митохондриален мембранен потенциал

Потенциалът на митохондриалната мембрана в клетките H9C2 се определя с помощта на багрилото JC-1 (Кат. No: C2006; Beyotime, Китай). Накратко, клетките H9C2 се промиват три пъти с PBS и след това се оцветяват с JC-1 за 30 минути на тъмно. След това клетките бяха измити три пъти с PBS и изображенията бяха заснети с помощта на конфокален микроскоп Nikon A1 (van Duinen et al., 2019).

Митохондриално ROS оцветяване

Оцветихме клетките H9C2 с червено Mitosox, митохондриално супероксидно оцветител, както беше описано по-рано (Aluja et al., 2019). Накратко, клетките H9C2 бяха промити три пъти с PBS и след това оцветени с Mitosox червено в продължение на 30 минути на тъмно. След това, след измиване на клетките с PBS, изображенията бяха заснети с конфокален микроскоп Nikon A1.

ТУНЕЛ Оцветяване

Клетките H9C2 бяха инкубирани с крайния ензим дезоксинуклеотидил трансфераза (TdT) и 2'-дезоксиуридин 5'-трифосфат (dUTP) при 37 ° С за 1 h (Coverstone et al., 2018). След това ядрата се оцветяват с 4 ', 6-диамино-2-фенилиндол (DAPI; Beyotime, C1006) в продължение на 5 минути. Оцветените клетки бяха заснети с помощта на флуоресцентен микроскоп (Olympus FV3000RS) и процентите на апоптотичните клетки бяха анализирани за всяка проба.

MTT анализ

MTT анализът се извършва, както е описано по-горе. Накратко, засяхме 1 х 104 клетки H9C2 на гнездо в 96-гнездни плаки за една нощ, последвано от инкубация с LPS в продължение на 24 часа. След това, след отстраняване на средата, се добавя прясна среда, допълнена с 0,5 mg/ml МТТ (Solarbio) и клетките се култивират за още 4 часа. След това средата се отстранява и образуваният в клетките продукт на формазан се екстрахира със 100 μl диметилсулфоксид (DMSO; Beyotime; Farber et al., 2018). Абсорбцията е отчетена при 570 nm с помощта на четец на микроплаки (ензимно свързана биотехнология, Шанхай, Китай) и жизнеспособността на клетките в експерименталната група е нормализирана към контролата (Rusnati et al., 2019).

Количествена PCR в реално време

Общата РНК от клетки H9C2 се изолира, както е описано по-рано (Wolint et al., 2019), използвайки Quick-RNA MicroPrep кит (Zymo изследвания). След това 150–250 ng обща РНК се транскрибира обратно, използвайки iScript cDNA кит за синтез (Bio-Rad). СДНК пробите се разреждат 10 пъти с ddH2O. Количествената PCR в реално време се извършва, като се използва 2 μl кДНК от всяка проба в LightCycler 480 (Roche). Относителната експресия на иРНК се изчислява, използвайки метода 2 ΔΔCt с 18S РНК като вътрешен контрол (Dassanayaka et al., 2019).

Статистика

Данните са изразени като средни стойности ± SEM. Студент с две опашки т-тестът беше използван за сравняване на две групи, а еднопосочен или двупосочен ANOVA с тест на Tukey’s беше използван за сравняване на множество групи. стр * стр * стр * стр * стр * стр 2+ претоварване при хронично постишемично сърдечно ремоделиране. Клетъчната смърт се различава. 27, 1907–1923. doi: 10.1038/s41418-019-0470-y

Silverblatt, J. A., Ziff, O. J., Dancy, L., Daniel, A., Carter, B., Scott, P., et al. (2019). Терапии за ограничаване на миокардното увреждане при животински модели на миокардит: систематичен преглед и мета-анализ. Основен Res. Кардиол. 114: 48. doi: 10.1007/s00395-019-0754-x

Song, X., и Li, T. (2019). Ripk3 медиира кардиомиоцитна некроза чрез насочване към митохондриите и пътя JNK-Bnip3 при нараняване с хипоксия и реоксигенация. J. Приемане. Предаване на сигнала. Рез. 39, 331–340. doi: 10.1080/10799893.2019.1676259

Su, H. H., Liao, J. M., Wang, Y. H., Chen, K. M., Lin, C. W., Lee, I. H., et al. (2019). Екзогенният GDF11 отслабва неканоничната TGF-бета сигнализация, за да предпази сърцето от остра миокардна исхемия-реперфузия. Основен Res. Кардиол. 114:20. doi: 10.1007/s00395-019-0728-z

Trindade, F., Vitorino, R., Leite-Moreira, A. и Falcao-Pires, I. (2019). Перикардна течност: недооценена молекулярна библиотека на сърдечните заболявания и потенциално средство за сърдечна терапия. Основен Res. Кардиол. 114: 10. doi: 10.1007/s00395-019-0716-3

Turunen, S. P., von Nandelstadh, P., Ohman, T., Gucciardo, E., Seashore-Ludlow, B., Martins, B., et al. (2019). FGFR4 фосфорилира MST1, за да придаде устойчивост на клетките на рака на гърдата към MST1/2-зависима апоптоза. Клетъчната смърт се различава. 26, 2577–2593. doi: 10.1038/s41418-019-0321-x

van Duinen, V., Zhu, D., Ramakers, C., van Zonneveld, A. J., Vulto, P. и Hankemeier, T. (2019). Perfused 3D ангиогенно покълване във високопроизводителна in vitro платформа. Ангиогенеза 22, 157–165. doi: 10.1007/s10456-018-9647-0

Walraven, M., Homs, M. Y. V., van der Veldt, A. A. M., Dekker, H., Koldenhof, J., Honeywell, R., et al. (2018). Функцията на тромбоцитите се нарушава от инхибиторите на ангиогенезата сунитиниб и сорафениб, но не се влияе от бевацизумаб. Ангиогенеза 21, 325–334. doi: 10.1007/s10456-018-9598-5

Wang, X., Ha, T., Liu, L., Hu, Y., Kao, R., Kalbfleisch, J., et al. (2018). TLR3 посредничи за възстановяване и регенерация на увредено новородено сърце чрез зависима от гликолиза YAP1 експресия на miR-152. Клетъчната смърт се различава. 25, 966–982. doi: 10.1038/s41418-017-0036-9

Wang, M., Smith, K., Yu, Q., Miller, C., Singh, K. и Sen, C. K. (2019). Митохондриален конексин 43 при зависими от пола миокардни реакции и медиирана от естроген сърдечна защита след остра исхемия/реперфузионно увреждане. Основен Res. Кардиол. 115: 1. doi: 10.1007/s00395-019-0759-5

Wang, J., Toan, S. и Zhou, H. (2020a). Контрол на качеството на митохондриите при сърдечно-микроваскуларна исхемия-реперфузионно увреждане: ново разбиране за механизмите и терапевтичните възможности. Pharmacol. Рез. 156: 104771. doi: 10.1016/j.phrs.2020.104771

Wang, J., Toan, S. и Zhou, H. (2020b). Нови прозрения за ролята на митохондриите при сърдечна микроваскуларна исхемия/реперфузионно увреждане. Ангиогенеза 23, 299–314. doi: 10.1007/s10456-020-09720-2

Wider, J., Undyala, V. V. R., Whittaker, P., Woods, J., Chen, X. и Przyklenk, K. (2018). Дистанционната исхемична предварителна подготовка не успява да намали размера на инфаркта в модела на тлъсти плъхове на Zucker при диабет тип 2: роля на дефектната хуморална комуникация. Основен Res. Кардиол. 113: 16. doi: 10.1007/s00395-018-0674-1

Wolint, P., Bopp, A., Woloszyk, A., Tian, ​​Y., Evrova, O., Hilbe, M., et al. (2019). Клетъчното самосглобяване в 3D микротъкани повишава ангиогенната активност и функционалната способност за неоваскуларизация на човешките кардиопоетични стволови клетки. Ангиогенеза 22, 37–52. doi: 10.1007/s10456-018-9635-4

Won, G. W., Sung, M., Lee, Y. и Lee, Y. H. (2019). MST2 киназата регулира диференциацията на остеобластите чрез фосфорилиране и инхибиране на Runx2 в клетки C2C12. Biochem. Biophys. Рез. Общ. 512, 591–597. doi: 10.1016/j.bbrc.2019.03.097

Yang, Z., Zheng, B., Zhang, Y., He, M., Zhang, X. H., Ma, D., et al. (2015). miR-155-зависима регулация на стерилна 20-подобна киназа 2 (MST2) на бозайници координира възпалението, оксидативния стрес и пролиферацията в гладкомускулните клетки на съдовете. Biochim. Biophys. Acta 1852, 1477–1489. doi: 10.1016/j.bbadis.2015.04.012

Zhang, H., Jin, B. и Faber, J. E. (2019a). Миши модели на болестта на Алцхаймер причиняват разреждане на пиларните обезпечения и повишена тежест на исхемичен инсулт. Ангиогенеза 22, 263–279. doi: 10.1007/s10456-018-9655-0

Zhang, H. F., Wang, Y. L., Tan, Y. Z., Wang, H. J., Tao, P. и Zhou, P. (2019b). Подобряване на сърдечната лимфангиогенеза чрез трансплантация на CD34 + VEGFR-3 + ендотелни прогениторни клетки и продължително освобождаване на VEGF-C. Основен Res. Кардиол. 114: 43. doi: 10.1007/s00395-019-0752-z

Zheng, Q., Pan, L. и Ji, Y. (2019). H 2S предпазва от ускорена от диабет атеросклероза, като предотвратява активирането на NLRP3 инфламазома. J. Biomed. Рез. 34, 94–102. doi: 10.7555/JBR.33.20190071

Zhong, J., Tan, Y., Lu, J., Liu, J., Xiao, X., Zhu, P., et al. (2019). Терапевтичен принос на мелатонин за лечението на септична кардиомиопатия: нов механизъм, свързващ модифицирана Ripk3 митохондриална производителност и функция на ендоплазмен ретикулум. Redox Biol. 26: 101287. doi: 10.1016/j.redox.2019.101287

Zhou, H., Wang, J., Zhu, P., Zhu, H., Toan, S., Hu, S., et al. (2018а). NR4A1 влошава сърдечно-микроваскуларната реперфузия на исхемия чрез потискане на FUNDC1-медиирана митофагия и насърчаване на Mff-необходимо митохондриално делене от CK2alpha. Основен Res. Кардиол. 113: 23. doi: 10.1007/s00395-018-0682-1

Zhou, H., Zhu, P., Wang, J., Toan, S. и Ren, J. (2019). DNA-PKcs насърчава свързано с алкохола чернодробно заболяване, като активира свързаното с Drp1 митохондриално делене и потиска митофагията, необходима за FUNDC1. Предаване на сигнала. Целева тер. 4:56. doi: 10.1038/s41392-019-0094-1

Zhou, H., Zhu, P., Wang, J., Zhu, H., Ren, J. и Chen, Y. (2018b). Патогенезата на реперфузионното увреждане на сърдечната исхемия е свързана с нарушена CK2alpha митохондриална хомеостаза чрез потискане на свързаната с FUNDC1 митофагия. Клетъчната смърт се различава. 25, 1080–1093. doi: 10.1038/s41418-018-0086-7

Ziegler, D. (2005). Диабет тип 2 като възпалително сърдечно-съдово разстройство. Curr. Мол. Med. 5, 309–322. doi: 10.2174/1566524053766095

Ключови думи: Mst2, възпаление, митохондриално делене, кардиомиоцит, FCCP

Цитиране: Tian Y, Song H, Qin W, Ding Z, Zhang Y, Shan W и Jin D (2020) Mammalian STE20-Like Kinase 2 Promotes Lipopolysaccharides-Mediated Cardiomyocyte възпаление и апоптоза чрез засилване на митохондриалното делене. Отпред. Физиол. 11: 897. doi: 10.3389/fphys.2020.00897

Получено: 28 май 2020 г .; Приет: 02 юли 2020 г .;
Публикувано: 06 август 2020 г.

Хао Джоу, Обща болница на народната армия за освобождение, Китай

Анна Шмид, Университет на Западен щат Колорадо, САЩ
Джин Уанг, първа свързана болница на китайската обща болница PLA, Китай
Ин Тан, Южен медицински университет, Китай