Клиничен диабет

Редактиран от
Гаетано Сантули

Колумбийският университет, САЩ

Прегледан от
Мария Феличе Брици

Университет в Торино, Италия

Eija K. Laakkonen

Университет в Ювяскюля, Финландия

Принадлежностите на редактора и рецензенти са най-новите, предоставени в техните профили за проучване на Loop и може да не отразяват тяхното положение по време на прегледа.

diabetes

  • Изтеглете статия
    • Изтеглете PDF
    • ReadCube
    • EPUB
    • XML (NLM)
    • Допълнителни
      Материал
  • Цитат за износ
    • EndNote
    • Референтен мениджър
    • Прост ТЕКСТ файл
    • BibTex
СПОДЕЛИ НА

Оригинални изследвания СТАТИЯ

  • 1 Катедра по физиология и биофизика, Институт по биомедицински науки, Университет на Сао Пауло, Сао Пауло, Бразилия
  • 2 Instituto de Medicina Molecular, Faculdade de Medicina, Universidade de Lisboa, Лисабон, Португалия

Намалената експресия на разтворено семейство носители 2, улеснен член-транспортер на глюкоза 4 (GLUT4) и хексокиназа-2 (HK2) в скелетните мускули участва в инсулиновата резистентност на захарен диабет (DM). МикроРНК (miRNAs) се появяват като важни модулатори на експресията на иРНК/протеини, но тяхната роля в DM е неясна. Изследвахме miRNAs, хипотетично участващи в експресията на GLUT4/HK2 в мускула на солеус при плъхове, подобни на диабет тип 1. В силико анализът разкри 651 miRNAs, предвидени да регулират семейство носители на разтворени вещества 2 член 4 (Slc2a4) тРНК, някои от тях също предвиждаха да регулират Hk2 иРНК и 16 миРНК са избрани за количествено определяне. Намален диабет Slc2a4/ GLUT4 и Hk2/ Експресия на HK2 (50–77%), регулирано miR-29b-3p и miR-29c-3p (50–100%) и регулирано надолу miR-93-5p, miR-150-5p, miR-199a-5p, miR -345-3p и miR-532-3p (

30%) израз. Освен това GLUT4 и HK2 протеините корелират (P ®, Cristália, Itapira, SP, Бразилия). Тринадесет дни по-късно животните са претеглени и държани в метаболитни клетки в продължение на 24 часа, за да се оцени обемът на урината, гликозурия и гликемия; тези променливи бяха използвани за потвърждаване на състоянието на диабет и за формиране на трите експериментални групи: недиабетни (ND), диабетици, инжектирани с 0,9% NaCl като плацебо (D), и диабетици, лекувани с NPH инсулин (ID). Лечението с инсулин се извършва два пъти дневно (2 U в 8:00 ч и 4 U в 17:00 ч; Humulin ®, Eli Lilly and Company, Индианаполис); и плацебо се инжектира едновременно. Леченията се провеждаха в продължение на 7 дни, общо 21 дни диабет.

В края на експерименталния период животните отново бяха държани в метаболитни клетки за 24-часово събиране на урина. След това между 8:00 и 10:00 часа (след 3-4 часа лишаване от храна) животните се упояват с 50 mg/kg натриев тиопентал (Cristália, Itapira, Сао Пауло, Бразилия), събира се кръвна опашка за глюкоза измерване и скелетните мускули на солеуса се събират внимателно, претеглят се и се съхраняват при -70 ° C за по-нататъшен анализ. Освен това се извършва лапаротомия за събиране на кръв от долната куха вена, за да се получи плазма за анализ на фруктозамин.

Всички експериментални процедури са одобрени от Етичния комитет за изследване на животните към Института по биомедицински науки към Университета в Сао Пауло (протокол 157/2012) и са в съответствие със съответните насоки и разпоредби.

Кръвна глюкоза, 24-часова екскреция на глюкоза в урината и плазмен фруктозамин

Концентрацията на глюкоза в кръвта се измерва с глюкомер (Accu-Check Active Basel, Швейцария). Проба от 24-часова урина беше използвана за измерване на концентрацията на глюкоза чрез ензимно-колориметричен метод (Glicose Liquiform, Labtest Diagnóstico S.A., Lagoa Santa, MG, Бразилия); обемът на урината се използва за изчисляване на 24-часовата екскреция на глюкоза. Концентрацията на фруктозамин в плазмата е измерена по кинетично-колориметричен метод (Frutosamina, Labtest Diagnóstico S.A., Lagoa Santa, MG, Бразилия).

Протеинов анализ чрез Western Blotting

Оценката на експресията на протеин се извършва, както е описано по-рано (11, 28). Накратко, замразени мускулни проби се хомогенизират в захарозен буфер с рН 7,4 (10 mmol/L Tris – HCl, 1 mmol/L EDTA и 250 mmol/L захароза), центрофугират се при 760 g за 10 минути при 4 ° C и супернатантата се използва се като обща клетъчна протеинова фракция. Концентрацията на протеин се определя по метод на Брадфорд (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA).

Равни количества протеин (20-50 μg, според целевия протеин) бяха електрофорезирани, прехвърлени в нитроцелулозна мембрана и имуноблотирани с анти-GLUT4 (1: 3500, EMD Millipore, Billerica, МА, САЩ, # 07-1404), анти -HK2 (1: 1,000, Cell Signaling Technology, Бостън, Масачузетс, САЩ, # 2867S), anti-NFKB1 (1: 1000, Cell Signaling Technology, Boston, MA, USA, # 12540S) или anti-RELA (1: 450, Abcam, Кеймбридж, Масачузетс, САЩ, # 7970). Мембраните се инкубират с подходящо вторично конюгирано антитяло, съгласно спецификациите на производителя, и сигналът се открива чрез подобрена процедура на хемилуминесценция. Оптичната плътност на петна е количествено определена чрез денситометрия (ImageScanner III, GE Healthcare, Упсала, Швеция) и нормализирана чрез денситометрията на съответната лента, измерена в оцветената мембрана на Ponceau S (29). Резултатите бяха изразени като произволни единици (AU) на μg протеин и като се вземат предвид средните стойности на контролните стойности като 100.

Анализ на генната експресия чрез RT-qPCR

Оценката на експресията на иРНК се извършва чрез количествена полимеразна верижна реакция в реално време с обратна транскрипция (RT-qPCR), както е описано по-рано (30). Накратко, общата РНК от замразени мускулни проби бяха изолирани с TRIzol ® Reagent (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), съгласно спецификациите на производителя. Общата концентрация на РНК във всяка проба се определя количествено спектрофотометрично (Epoch, BioTek Instruments, Winooski, VT, USA) и чистотата на РНК се изчислява от съотношението A260/A280. Целостта на РНК се проверява чрез наличието на 18S и 28S ленти в 1% денатурираща агарозна гел електрофореза, изложена на ултравиолетова светлина (Epi Chemi II Darkroom, UVP BioImaging Systems, Upland, Калифорния, Калифорния, САЩ).

маса 1. Подробности за праймерите и идентификационните (ID) кодове на анализите за генна експресия TaqMan, използвани за количествена полимеразна верижна реакция в реално време (qPCR).

Анализ на експресия на miRNA чрез RT-qPCR

Оценката на експресията на miRNA се извършва, както е описано по-рано (32). Накратко, общите проби от РНК (100 ng) бяха обратно транскрибирани, използвайки TaqMan® MicroRNA комплект за обратна транскрипция и специфични miRNA праймери от TaqMan® MicroRNA Assays (Applied Biosystems Inc., Foster City, CA, USA). Условията на RT бяха: 30 минути при 16 ° С, 30 минути при 42 ° С, 5 минути при 85 ° С, последвано от охлаждане при 4 ° С. CDNAs на всяка miRNA бяха амплифицирани с помощта на TaqMan ® 2X Universal PCR Master Mix, No AmpErase ® UNG и специфични сонди за целевите miRNAs (Applied Biosystems Inc., Foster City, CA, USA), използвайки StepOne Plus Instrument (Applied Biosystems Inc ., Фостър Сити, Калифорния, САЩ). Условията за PCR бяха 1 цикъл от 10 минути при 95 ° С и 45 цикъла от 15 секунди при 95 ° С и 1 минута при 60 ° С. Целевите последователности и идентификационните номера на анализа за miRNAs и референтни гени са показани в Таблица 2. Избраният референтен ген е U6 snRNA, съгласно алгоритъмния анализ RefFinder. Методът на 2 −ΔΔCt беше приет за анализ (31).

Таблица 2. Целеви последователности и идентификатори за анализ на Taqman на miRNAs и референтните гени.

В силико Анализ на miRNAs Предвиждат да регулират целеви гени

Търсенето на miRNAs, насочени към mRNAs Slc2a4, Hk2, Nfkb1 и Рела беше извършено с помощта на базата данни miRWalk 2.0, изчерпателен атлас на предсказани и валидирани взаимодействия на miRNA-target (33). Анализът беше ограничен до целевата иРНК 3'-UTR област на плъх Slc2a4, Hk2 и Рела гени и на човека NFKB1 ген, тъй като няма данни, отнасящи се до плъх Nfkb1 ген в базата данни miRWalk. Официалната номенклатура и анотиране на последователността на miRNAs се основава на „miRBase Sequence Database-Release 21“.

Статистически анализ

Всички данни са изразени като средна стойност ± средна стандартна грешка (SEM). Сравнението на средствата, според нормалността на разпределението на данните (тест на Шапиро-Уилк), се извършва чрез еднопосочен дисперсионен анализ (ANOVA) или тест на Крускал-Уолис, последван от Bonferroni или Dunn post hoc тест, съответно. Корелациите между протеини и miRNAs, или метаболитни променливи и miRNAs, бяха извършени чрез анализ на коефициента на корелация на Pearson (r) или Spearman (ρ). Сравненията се считат за статистически значими при стр # P ### P # P ## P # P # P −ΔΔCT Метод. Методи (2001) 25: 402–8. doi: 10.1006/meth.2001.1262

32. Gerlinger-Romero F, Yonamine CY, Junior DC, Esteves JV, Machado UF. Дисрегулация между експресия на TRIM63/FBXO32 и загуба на мускули на солеус при диабетни плъхове: потенциална роля на miR-1-3p, -29a/b-3p и-133a/b-3p. Mol Cell Biochem. (2017) 427: 187–99. doi: 10.1007/s11010-016-2910-z

33. Dweep H, Gretz N. miRWalk2.0: изчерпателен атлас на взаимодействията microRNA-target. Методи Nat (2015) 12: 697. doi: 10.1038/nmeth.3485

34. He A, Zhu L, Gupta N, Chang Y, Fang F. Свръхекспресията на микро рибонуклеинова киселина 29, силно регулирана при диабетни плъхове, води до инсулинова резистентност в 3T3-L1 адипоцитите. Mol Endocrinol. (2007) 21: 2785–94. doi: 10.1210/мен.2007-0167

35. Massart J, Sjögren RJO, Lundell LS, Mudry JM, Franck N, O'Gorman DJ, et al. Променената експресия на miR-29 при диабет тип 2 влияе върху метаболизма на глюкозата и липидите в скелетните мускули. Диабет (2017) 66: 1807–18. doi: 10.2337/db17-0141

36. Chen YH, Heneidi S, Lee JM, Layman LC, Stepp DW, Gamboa GM, et al. miRNA-93 инхибира GLUT4 и е свръхекспресиран в мастната тъкан на пациенти със синдром на поликистозните яйчници и жени с инсулинова резистентност. Диабет (2013) 62: 2278–86. doi: 10.2337/db12-0963

37. Чавали V, SC Tyagi, Mishra PK. Диференциална експресия на Dicer, miRNAs и възпалителни маркери в диабет Ins2 +/- Акита сърца. Cell Biochem Biophys. (2014) 68: 25–35. doi: 10.1007/s12013-013-9679-4

38. Punga T, Le Panse R, Andersson M, Truffault F, Berrih-Aknin S, Punga AR. Циркулиращи miRNAs в миастения гравис: miR-150-5p като нов потенциален биомаркер. Ann Clin Transl Neurol. (2014) 1: 49–58. doi: 10.1002/acn3.24

39. Yan ST, Li CL, Tian H, Li J, Pei Y, Liu Y, et al. MiR-199a е свръхекспресиран в плазмата на пациенти с диабет тип 2, което допринася за диабет тип 2 чрез насочване към GLUT4. Mol Cell Biochem. (2014) 397: 45–51. doi: 10.1007/s11010-014-2170-8

40. Barsanti C, Trivella MG, D'Aurizio R, El Baroudi M, Baumgart M, Groth M, et al. Диференциалната регулация на микроРНК в сърдечно-съдовите недостатъци в краен стадий е свързана с разтоварване на помощно устройство на лявата камера. Biomed Res Int. (2015) 2015: 592512. doi: 10.1155/2015/592512

41. Chen L, Chen Y, Zhang S, Ye L, Cui J, Sun Q, et al. MiR-540 като нов адипогенен инхибитор уврежда адипогенезата чрез потискане на PPARγ. J Cell Biochem. (2015) 116: 969–76. doi: 10.1002/jcb.25050

42. Lee KP, Shin YJ, Panda AC, Abdelmohsen K, Kim JY, Lee SM, et al. miR-431 насърчава диференциацията и регенерацията на старите скелетни мускули чрез насочване към Smad4. Гени Dev (2015) 29: 1605–17. doi: 10.1101/gad.263574.115

43. Wang JX, Zhang XJ, Feng C, Sun T, Wang K, Wang Y, et al. MicroRNA-532-3p регулира митохондриалното делене чрез насочване на апоптозен репресор с домен за рекрутиране на каспаза при кардиотоксичност на доксорубицин. Клетъчна смърт Dis. (2015) 6: e1677. doi: 10.1038/cddis.2015.41

44. Kushwaha P, Khedgikar V, Sharma D, Yuen T, Gautam J, Ahmad N, et al. MicroRNA 874-3p упражнява скелетни анаболни ефекти епигенетично по време на отбиването чрез потискане на експресията на Hdac1. J Biol Chem. (2016) 291: 3959–66. doi: 10.1074/jbc.M115.687152

45. Wang KJ, Zhao X, Liu YZ, Zeng QT, Mao XB, Li SN, et al. Циркулиращите MiR-19b-3p, MiR-134-5p и MiR-186-5p са обещаващи нови биомаркери за ранна диагностика на остър миокарден инфаркт. Cell Physiol Biochem. (2016) 38: 1015–29. doi: 10.1159/000443053

46. ​​Zhou T, Zhou T, Meng X, Che H, Shen N, Xiao D, Song X, et al. регулиране на инсулиновата резистентност чрез множество MiRNAs чрез насочване на сигналния път GLUT4. Cell Physiol Biochem. (2016) 38: 2063–78. doi: 10.1159/000445565

47. Zhu XD, Chi JY, Liang HH, Huangfu LT, Guo ZD, Zou H, et al. MicroRNA-377 медиира апоптоза на кардиомиоцитите, индуцирана от циклоспорин А. Може ли J Cardiol. (2016) 32: 1249–59. doi: 10.1016/j.cjca.2015.11.012

48. Wallberg-Henriksson H, Zierath JR. GLUT4: ключов играч, регулиращ хомеостазата на глюкозата Прозрения от трансгенни и нокаутиращи мишки (преглед). Mol Membr Biol. (2001) 18: 205–11. doi: 10.1080/09687680110072131

49. Krook A. Балансиращ акт за оптимизиране на дозата инсулин и инсулиновата чувствителност при диабет тип 1. J Ендокринол. (2011) 211: 1–2. doi: 10.1530/JOE-11-0263

50. Patel OV, Casey T, Dover H, Plaut K. Хомеоретична адаптация към лактацията: сравнителен анализ на транскриптома на млечната жлеза, черния дроб и мастната тъкан по време на прехода от бременност към лактация при плъхове. Функционална цялостна геномика (2011) 11: 193–202. doi: 10.1007/s10142-010-0193-0

51. Ruan H, Zarnowski MJ, Cushman SW, Lodish HF. Стандартната изолация на първични мастни клетки от епидидимни мастни подложки на мишки индуцира възпалителни медиатори и регулира надолу адипоцитните гени. J Biol Chem. (2003) 278: 47585–93. doi: 10.1074/jbc.M305257200

52. Kahn BB, Rosen AS, Bak JF, Andersen PH, Damsbo P, Lund S, et al. Експресия на GLUT1 и GLUT4 глюкозни транспортери в скелетните мускули на хора с инсулинозависим захарен диабет: регулаторни ефекти на метаболитните фактори. J Clin Endocrinol Metab. (1992) 74: 1101–9.

53. Клип А, Цакиридис Т, Марет А, Ортис ПА. Регулиране на експресията на транспортьори на глюкоза чрез глюкоза: преглед на проучванията in vivo и в клетъчните култури. FASEB J. (1994) 8: 43-53.

54. Neufer PD, Carey JO, Dohm GL. Транскрипционно регулиране на гена за глюкозен транспортер GLUT4 в скелетните мускули. Ефекти от диабета и гладуването. J Biol Chem. (1993) 268: 13824–9.

55. Hager SR, Pastorek D, Jochen AL, Meier D. Разминаване между GLUT4 иРНК и изобилие на протеини в скелетните мускули на инсулиноустойчиви плъхове. Biochem Biophys Res Commun. (1991) 181: 240-5.

56. Seraphim PM, Nunes MT, Giannocco G, Machado UF. Индуцирано от възрастта съкращаване на дължината на опашката на GLUT4 mRNA poly (A) при скелетните мускули на гастрокнемиуса на плъхове. Ендокринол на Mol Cell. (2007) 276: 80–7. doi: 10.1016/j.mce.2007.07.004

57. Zhou Y, Gu P, Shi W, Li J, Hao Q, Cao X, et al. MicroRNA-29a индуцира инсулинова резистентност чрез насочване на PPARδ в скелетните мускулни клетки. Int J Mol Med. (2016) 37: 931–8. doi: 10.3892/ijmm.2016.2499

58. Guedes EC, França GS, Lino CA, Koyama FC, Moreira Ldo N, Alexandre JG, et al. Подписът на експресията на MicroRNA се променя в сърдечното ремоделиране, предизвикано от диети с високо съдържание на мазнини. J Cell Physiol. (2016) 231: 1771–83. doi: 10.1002/jcp.25280

59. Song H, Ding L, Zhang S, Wang W. Членовете на семейството на MiR-29 взаимодействат със SPARC, за да регулират метаболизма на глюкозата. Членовете на семейството MiR-29 взаимодействат със SPARC, за да регулират метаболизма на глюкозата. Biochem Biophys Res Commun. (2018) 497: 667–674. doi: 10.1016/j.bbrc.2018.02.129

60. Guo W, Qiu Z, Wang Z, Wang Q, Tan N, Chen T, et al. MiR-199a-5p е отрицателно свързан със злокачествени заболявания и регулира гликолизата и производството на лактат чрез насочване на хексокиназа 2 при рак на черния дроб. Хепатология (2015) 62: 1132–44. doi: 10.1002/hep.27929

61. Zhou Y, Zheng X, Lu J, Chen W, Li X, Zhao L. Ginsenoside 20 (S) -Rg3 инхибира ефекта на warburg чрез модулиране на DNMT3A/MiR-532-3p/HK2 в раковите клетки на яйчниците. Cell Physiol Biochem. (2018) 45: 2548–2559. doi: 10.1159/000488273

62. Valinezhad Orang A, Safaralizadeh R, Kazemzadeh-Bavili M. Механизми на miRNA-медиирана генна регулация от общо понижаване до mRNA-специфично повишаване на регулирането. Int J Genomics (2014) 2014: 970607. doi: 10.1155/2014/970607

63. Furuya DT, Neri EA, Poletto AC, Anhê GF, Freitas HS, Campello RS, et al. Идентифициране на сайтове на ядрен фактор-кВ в промотора на гена Slc2a4. Ендокринол на Mol Cell. (2013) 370: 87–95. doi: 10.1016/j.mce.2013.01.019

64. Hassan T, Carroll TP, Buckley PG, Cummins R, O'Neill SJ, McElvaney NG, et al. miR-199a-5p заглушаването регулира разгънатия протеинов отговор при хронична обструктивна белодробна болест и дефицит на α1-антитрипсин. Am J Respir Crit Care Med. (2014) 189: 263–73. doi: 10.1164/rccm.201306-1151OC

Ключови думи: микроРНК, скелетни мускули, GLUT4, хексокиназа, метаболизъм на глюкозата, усвояване на глюкоза, NFKB, стрептозотоцин

Позоваване: Esteves JV, Yonamine CY, Pinto-Junior DC, Gerlinger-Romero F, Enguita FJ и Machado UF (2018) Диабетът модулира микроРНК 29b-3p, 29c-3p, 199a-5p и 532-3p Експресия в мускулите: Възможна роля в GLUT4 и HK2 Репресия. Отпред. Ендокринол. 9: 536. doi: 10.3389/fendo.2018.00536

Получено: 25 юни 2018 г .; Приет: 23 август 2018 г .;
Публикувано: 12 септември 2018 г.

Гаетано Сантули, Колумбийският университет, САЩ

Maria Felice Brizzi, Università degli Studi di Torino, Италия
Eija K. Laakkonen, Университет в Ювяскюла, Финландия