Стомашно-чревна и чернодробна фармакология

Редактиран от
Рафаеле Капасо

Университет в Неапол Федерико II, Италия

Прегледан от
Казуо Накамото

Университет Кобе Гакуин, Япония

Ерика Ново

Университет в Торино, Италия

Принадлежностите на редактора и рецензенти са най-новите, предоставени в техните профили за проучване на Loop и може да не отразяват тяхното положение по време на прегледа.

защитава

  • Изтеглете статия
    • Изтеглете PDF
    • ReadCube
    • EPUB
    • XML (NLM)
    • Допълнителни
      Материал
  • Цитат за износ
    • EndNote
    • Референтен мениджър
    • Прост ТЕКСТ файл
    • BibTex
СПОДЕЛИ НА

Оригинални изследвания СТАТИЯ

  • 1 Лаборатория по липидна биология и метаболитни заболявания, Училище за здраве и биомедицински науки, Университет RMIT, Мелбърн, VIC, Австралия
  • 2 Училище за биотехнологии и здравни науки, Университет Wuyi, Jiangmen, Китай

Въведение

Безалкохолната мастна чернодробна болест (NAFLD) е най-често срещаното хронично чернодробно заболяване с 25% разпространение сред възрастните по света. Това метаболитно чернодробно заболяване варира от асимптоматични прости мазнини на черния дроб (или хепатостеатоза поради прекомерно натрупване на триглицериди в черния дроб) до необратими крайни етапи на чернодробна цироза или функционална недостатъчност (Rinella, 2015; Friedman et al., 2018). Безалкохолният стеатохепатит (NASH) е критичен етап в прогресията от ранния и обратим стадий на проста хепатостеатоза към сериозно увреждане на черния дроб и фиброза, които стават необратими при всяко лечение. Освен това постоянното възстановяване на увредените хепатоцити по време на прогресията на NASH може да предизвика развитието на хепатоцелуларен карцином, което също е друг краен етап на NAFLD (Diehl and Day, 2017). Ето защо е важно ефективното лечение на NASH, за да се предотврати или забави влошаването на NAFLD до нелечимите фетални етапи.

Безалкохолният стеатохепатит се характеризира с чернодробна стеатоза, нараняване (повишени чернодробни ензими в кръвообращението), възпаление и променлива степен на фиброза (Diehl и Day, 2017). Всъщност, за ефективно лечение на NASH, лекарството трябва да притежава терапевтична ефикасност при тези ключови патологии на крайните точки: а именно метаболитен стрес (посочен от подобряване на хепатостеатозата), възпаление и фиброза в черния дроб (Diehl и Day, 2017) Понастоящем повечето изследвани лекарства за лечение на NASH започват от определена клетъчна цел, като PPARα/δ, PPARα/γ, FXR, CCR2/5, SCD-1, ASK-1, ACC, инхибитор на каспаза, THR-β или комбинация от някои от тях (Friedman et al., 2018). Въпреки огромните усилия, все още няма одобрено лекарство специално за лечение на NASH (Diehl and Day, 2017).

Понастоящем е широко признато, че NASH може да е резултат от множество фактори (или „удари“), освен обикновена хепатостеатоза (първо „ударение“) (Tilg and Moschen, 2010). Освен това множествените попадения са хетерогенни при различните пациенти и могат да се представят по различен начин в патогенезата на NASH (Suzuki and Diehl, 2017). За да преодолеем предизвикателствата при насочването към определен клетъчен сайт за NASH като отправна точка и липсата на познания за информацията за безопасност, ние възприехме подхода за пренасочване (Turner et al., 2016) и идентифицирахме матрината като потенциално ново лекарство за лечението на NASH въз основа на докладваните му ефекти, свързани с метаболитен стрес, възпаление и фиброза (Diehl and Day, 2017).

Матрината (Mtr, известна като Kushen алкалоид) първоначално е изолирана от растението Sophora flavescens (Cheng et al., 2006) и се използва като хепатопротективно лекарство в Китай с минимални неблагоприятни ефекти (Liu et al., 2003). Съобщава се, че това лекарство с малка молекула (MW: 248) инхибира възпалението (Zhang et al., 2011; Sun et al., 2016). Освен това е доказано, че матринът предпазва от увреждане на черния дроб при модел на плъхове с исхемия и реперфузия (Zhu et al., 2002). Съвсем наскоро проучвания от нашата лаборатория демонстрираха терапевтичната му ефективност при елиминиране на хепатостеатоза в резултат на диета с високо съдържание на мазнини или диета с високо съдържание на фруктоза при мишки (Zeng et al., 2015; Mahzari et al., 2018). Важно е, че тези терапевтични ефекти изглежда включват пътя на протеина на топлинния шок (HSP), но не и тези общопризнати клетъчни цели като PPARα, PPARγ или AMPK (Zeng et al., 2015; Mahzari et al., 2018). Тези два модела на мишки обаче нямат фенотипите на чернодробно възпаление и фиброза, за да можем да оценим терапевтичните му ефекти върху NASH (Friedman et al., 2018).

Следователно, настоящото проучване има за цел да оцени ефектите на матрината върху увреждането на черния дроб, възпалението и фиброзата при мишки, индуцирани от диета с дефицит на метионин холин (MCD), добре дефиниран модел на NASH (Diehl и Day, 2017). Участващият механизъм беше допълнително проучен чрез изследване на свързаните промени в пътя на HSP и сравняване с тези, произведени от метформин, антидиабетно лекарство, за което се предполага, че има ползи за NASH (Clarke et al., 2015).

Материали и методи

Грижа за животните и експериментален дизайн

Мъжките мишки C57BL/6J (на 10 седмици) бяха закупени и аклиматизирани за поне 1 седмица. Мишките бяха разпределени на случаен принцип в четири групи: хранене ad libitum със стандартна диета с чау (CH-Con; Gordon’s Specialty Stock Feeds, Yanderra, NSW, Австралия); MCD самостоятелно (MCD-Con); MCD с матриново лечение като хранителна добавка (MCD-Mtr; Mtr: 100 mg/kg/ден); и MCD с лечение с метформин като хранителна добавка (MCD-Met; Met: 250 mg/kg/ден) в продължение на 6 седмици. Дозите матрин и метформин са базирани на нашите предишни публикации (Zeng et al., 2015; Mahzari et al., 2018). Матрин (чистота> 99,5%) е подарък от професор Ли-Хонг Ху от Шанхайския институт по материя Медика (Китай), а метформинът е закупен от Sigma-Aldrich (Австралия). Лекарствените прахове се съхраняват при -20 ° C, след което се претеглят и внимателно се смесват с диета всеки ден. Всички експерименти са одобрени от Комитета по етика на животните към Университета RMIT (# 1415) в съответствие с насоките на Националния съвет за здравни и медицински изследвания на Австралия.

Метаболитни оценки

Телесното тегло и приема на храна се наблюдават ежедневно по време на експеримента. Преди началото на проучването и след 5 седмици, след 5-7 часа отстраняване на храната, се събира кръв от вените на опашката за измерване на глюкозата с глюкомер (Accu-Check II; Roche, Castle Hill, Perth, Australia). Преди началото на проучването и в края на изследването, плазмата се събира и съхранява при -80 ° C за последващо биохимично тестване. Мишките се анестезират със смес кетамин/ксилазин (до 100 mg/kg телесно тегло кетамин и 20 mg/kg телесно тегло ксилазин) се прилага чрез интраперитонеална инжекция. След това се извършва фиксиране на мишки чрез транскардиална перфузия с буфериран с хепаринизиран фосфат физиологичен разтвор (PBS; 10–20 ml/мишка), последван от 4% параформалдехид (PFA; 10–20 ml/мишка; # C007, ProSciTech). След завършване на перфузията с PFA, десният лоб на черния дроб беше дисектиран и потопен в 4% пълнени с PFA стъклени сцинтилационни флакони за допълнителен анализ.

Определяне на състава на телесните мазнини и съдържанието на триглицериди в черния дроб

Общото съдържание на телесни мазнини в мишки беше оценено с помощта на анализатора за състав на тялото EchoMRI TM -100H (EchoMRI). По време на този безвреден и неинвазивен анализ мишките бяха задържани на живо в тръба. Принципът на измерване на състава на мазнините в цялото тяло с помощта на EchoMRI TM -100H се основава на техниката на ядрено-магнитен резонанс (MRI), измерваща живия състав на тялото като мастна тъкан, чиста тъкан и свободна течност. Хепатостеатозата се оценява чрез измерване на съдържанието на TG в черния дроб, използвайки метода на Folch и колориметричен набор за анализ (Triglyceride GPO-PAP; Roche, Castle Hill, NSW, Австралия), както е описано по-рано (Ren et al., 2012).

Оценка на ефекта върху увреждането на черния дроб

Полимеразна верижна реакция в реално време на чернодробна РНК

Обща РНК беше изолирана от черен дроб на мишка, използвайки реагент TRIzol (Invitrogen, # 15596026), както беше описано по-рано (Zeng et al., 2012). PCR в реално време се извършва с помощта на IQ SYBR Green Supermix (Bio-Rad Laboratories Inc., САЩ) за гени от интерес. Експресията на целевия ген беше нормализирана към домакинския ген (18S). Последователността на праймера (5 'до 3') от 18S е CGC CGCTAGAGGTGAAATTCT (смисъл) и CGAACCTCCGACTTTCGTTCT (антисенс); TNFα: CACAAGATGCTGGGACAGTGA (смисъл) и TCCTTGATGGTGGTGCATGA (антисенс); IL-1β: CAACCAACAAGTGATATTCTCCATG (смисъл) и GATCCACACTCTCCAGCTGCA (антисенс); CD68: TGACCTGCTCTCTCTAAGGCTACA (смисъл) и TCACGGTTGCAAGAGAAACATG (антисенс); Колаген 1: CTGCTGGTGAGAGAGGTGAAC (смисъл) и ACCAAGGTCTCCAGGAACAC (антисенс).

Западно петно

Чернодробните лизати се отделят чрез SDS-PAGE и се имуноблотират със специфични антитела (Chan et al., 2013). Антителата се разреждат 1: 500 (за HSF1, HSP72 и HSP90) или 1: 1000 (за други антитела) с TBST буфер, съдържащ 1% BSA, 0,02% натриев азид и 0,0025% фенолно червено (Sigma-Aldrich, Австралия). Антитела за HSP72 и HSP90 са закупени от Enzo Life Sciences (Farmingdale, САЩ); MCP-1, HSF1, TGFβ, Smad3, мишена на рапамицин за бозайници (mTOR), фосфо Ser2448 mTOR, α-тубулин и GAPDH са закупени от Cell Signaling (Danvers, MA, САЩ). Подобен на кимване рецептор пирин, съдържащ 3 (NLPR3), е закупен от AdipoGen (Сан Диего, САЩ). Коза против мишка, коза против заек и коза против плъх от Санта Круз (САЩ). Количествените протеини се определят с помощта на ChemiDoc и се извършва анализ на денситометрията с помощта на софтуера Image Lab (Bio-Rad Laboratories, Австралия).

Хистологична оценка на чернодробните секции

Чернодробните проби се перфузират с PFA и се нарязват на 5 μm участъци. Свободно плаващите секции бяха оцветени с пикросириус в червено за чернодробна фиброза и след това бяха количествено определени в пет непокриващи се зрителни полета на животно с помощта на микроскоп Olympus BX41 с обектив 20 × и цифрова камера Olympus DP72 (Olympus, Австралия) Witek et al., 2009; Li et al., 2016). Средната стойност е изчислена за всяка експериментална група, използвайки функцията за праг в софтуерния пакет ImageJ (NIH, Bethesda, MD, САЩ). Данните са представени като процент (%) от положителната площ на поле. За да се получи статистическа значимост, бяха направени поне пет изображения с произволно поле на слайд и бяха оценени поне седем мишки на група (н = 7).

Статистически анализ

Всички резултати са представени като средни стойности ± SEM. Еднопосочен дисперсионен анализ е използван за оценка на статистическата значимост във всички групи. Когато бяха открити значителни разлики, множество сравнения на Tukey-Kramer post hoc тестът е използван за установяване на разлики между групите. Разлики при стр ∗ стр ∗∗ стр † стр ∗ стр † ст𠆆 п ∗ стр † ст𠆆 п ∗∗ ст𠆆 п ∗ стр ∗∗ стр † ст𠆆 п ∗ стр † ст𠆆 п Ключови думи: матрин, NASH, възпаление, фиброза, HSP72, mTOR, диета с дефицит на метионин холин

Цитиране: Mahzari A, Li S, Zhou X, Li D, Fouda S, Alhomrani M, Alzahrani W, Robinson SR и Ye JM (2019) Matrine Protects Against MCD-Induced Development of NASH чрез регулиране на HSP72 и понижаване на mTOR по начин, отличителен От метформин. Отпред. Pharmacol. 10: 405. doi: 10.3389/fphar.2019.00405

Получено: 03 ноември 2018 г .; Приет: 01 април 2019 г .;
Публикувано: 24 април 2019 г.

Рафаеле Капасо, Неаполски университет Федерико II, Италия

Кадзуо Накамото, Университет Кобе Гакуин, Япония
Ерика Ново, Университет в Торино, Италия