Резюме

Затлъстяването често се свързва с диабет тип 2. По-рано наблюдавахме връзка на функционален G/A полиморфизъм в промотора на несвързващия протеин 2 (UCP2) със затлъстяването. Алел от див тип G е свързан с намалена експресия на тРНК на мастната тъкан in vivo, намалена транскрипционна активност in vitro и повишен риск от затлъстяване. От друга страна, проучвания върху модели на животински и клетъчни култури идентифицират експресията на UCP2 на панкреатични β-клетки като основна детерминанта на секреторния отговор на инсулина към глюкозата. Поради това установихме връзките на полиморфизма -866G/A с β-клетъчната функция и риска от диабет при затлъстяване. Тук показваме, че панкреатичният транскрипционен фактор PAX6 за предпочитане се свързва и по-ефективно транс активира варианта от дивия тип UCP2 промоторен алел в β-клетъчната линия INS1-E. Чрез изследване на 39 затлъстели недиабетни хора, ние наблюдавахме разлики в генотипа във функцията на β-клетките; субекти от див тип показват по-голям индекс на диспозиция (продукт на инсулинова чувствителност и остър инсулинов отговор на глюкоза), отколкото субекти с вариантния алел (Р

  • Изтеглете фигура
  • Отваряне в нов раздел
  • Изтеглете powerpoint

полиморфизъм

За да изследваме PAX6-медиираните транскрипционни ефекти, ние временно трансфектирахме INS1-E клетки с вариантни и див тип UCP2 репортерни конструкции и наблюдавахме подобни активности на репортерни гени (1,00 ± 0,12 срещу 0,97 ± 0,14, NS) (фиг. 1Е). Котрансфекцията на PAX6A-изоформни вектори на експресия увеличава транскрипцията по-ефективно от варианта, отколкото алела от див тип (4,08 ± 0,63 срещу 3,44 ± 0,61 пъти индукция, P = 0,031, двупосочна ANOVA) и котрансфекция на PAX6B (съдържаща допълнителната exon 5a) индуцирани по-силни реакции от PAX6A (4.31 ± 0.31 срещу 3.21 ± 0.39, P Вижте тази таблица:

  • Преглед на линия
  • Преглед на изскачащия прозорец

UCP2 -866 G/A полиморфизъм и метаболитни параметри при затлъстели недиабетни пациенти

Тъй като както инсулиновата резистентност, така и нарушената компенсаторна регулация на инсулиновата секреция играят съществена роля в патогенезата на диабет тип 2 (17), тествахме дали полиморфизмът -866G/A е свързан с диабет тип 2 при затлъстели пациенти. Очакванията на Харди-Вайнберг бяха изпълнени във всички проучвани популации (Таблица 2). Разпределението на генотипа се различава между затлъстелите диабетици и контролните субекти, независимо от контрастните разлики във възрастта на контролните субекти и възрастта на пациентите при диагноза диабет. Оценените рискове от диабет при G/A и A/A субекти са сходни и при двете сравнения, в съответствие с рецесивния ефект на G алела (Таблица 3). По този начин, G/G генотипът, идентифициран като рисков генотип за затлъстяване, е свързан с двукратно намаляване на риска от диабет тип 2 при затлъстели лица. Специфичните за пола сравнения на пациенти с диабет с контролни субекти, комбинирани от двете популации, разкриват разлики в разпределението на генотипа при жените (P = 0,031), но не и в по-малката група мъже (P = 0,111). Използвайки 50 години като гранично ниво за възрастта на диагнозата диабет, ние наблюдавахме разлики в разпределението на генотипа както в по-младите (P = 0,025), така и в по-старите възрастови групи (P = 0,025).

Характеристики на изследваните пациенти със затлъстяване с диабет тип 2 и популации от затлъстяване

Резултати от асоциирането на полиморфизма -866G/A с диабет тип 2 при проучени популации със затлъстяване

Това проучване демонстрира връзка между полиморфизма -866G/A UCP2 и коригирания за възрастта риск от диабет тип 2 при пациенти със затлъстяване. Този резултат се подкрепя на физиологично ниво чрез влияние на полиморфизма върху индекса на разположение. На молекулярно ниво показваме, че PAX6, трансфактор, който е от съществено значение за функцията на панкреатичните островчета (3), влияе върху транскрипцията по специфичен за алела начин. Това, че полиморфизмът със скромни функционални ефекти увеличава риска от затлъстяване, но предпазва от метаболитното му усложнение, може да бъде изненадващо. Нашата селекция от субекти със затлъстяване може да е улеснила установяването на разликите в генотипа във функцията на β-клетките, тъй като затлъстяването неизменно се свързва с някаква степен на инсулинова резистентност, като по този начин насърчава компенсаторна хиперсекреция на инсулин от β-клетки (15).

Нашите резултати при хора са в съответствие с концепциите, възникнали при проучвания върху модели на животински и клетъчни култури (7–10,18). Специфично за алелите подобряване на експресията на UCP2 в β-клетките би намалило свързването на митохондриите и, като следствие, синтеза на АТФ и острата секреция на инсулин в отговор на глюкозата. Освен това ранната секреция на инсулин е доказано, че е от съществено значение за грундиране на чувствителни към инсулин тъкани и улесняване на усвояването на глюкозата (19,20). Следователно, алелът от промотор на UCP2 от див тип, благодарение на намалената му транскрипционна активност в β-клетките, може да бъде благоприятен за разширяване на мастната тъкан, като по този начин влошава риска от затлъстяване, който може да бъде резултат от намалена експресия на UCP2 в мастната тъкан (2). Ако нашите констатации се отнасят до други генетични среди и среди, UCP2 наистина ще играе контрастната роля при затлъстяването и диабета, която е била разгледана (11). Ситуацията обаче може да бъде още по-сложна, тъй като UCP2 може да поддържа функцията и целостта на β-клетките, като предпазва от окислително увреждане (21,22), като същевременно инхибира секрецията на инсулин (7–10). Дали някой от тези UCP2-медиирани ефекти предоставя предимство или става вреден, може да зависи от модифициращите гени и влиянията на околната среда.

ПРОЕКТИРАНЕ И МЕТОДИ НА ИЗСЛЕДВАНИЯТА

Учебни предмети.

Общо 201 несвързани пациенти с диабет тип 2 бяха наети от амбулаториите за диабет на Landeskliniken Salzburg, Krankenhaus Hallein и Университетската болница Инсбрук, всички разположени на разстояние 120 мили един от друг. Пациенти, които са били със затлъстяване (ИТМ> 30 kg/m 2) и 31 kg/m 2), участници в проучването SAPHIR (Програма за превенция на атеросклероза в Залцбург при пациенти с висок индивидуален риск) (2,23). В допълнение, 39 пациенти със затлъстяване без диабет тип 2 бяха наети за интравенозно тестване на глюкозен толеранс. Субектите са класифицирани като диабетици, ако са използвали хипогликемични лекарства или са имали плазмена концентрация на гладно ≥7,0 mmol/l. Проучваните популации обхващаха само бели европейци, предимно от баварски или австрийски немски произход. Участниците предоставиха информирано съгласие и проучването беше одобрено от местната комисия по етика.

Лабораторни анализи.

Плазмената глюкоза, инсулин, холестерол, триглицериди и лептин бяха измерени, както е описано (2). Нивата на HbA1c се определят чрез йонообменна хроматография. Типизирането на полиморфизма -866G/A UCP2 промотор и клонирането на репортерни конструкции се извършва, както е описано (2). Последователностите на праймера за клониране на PAX6A и -6B в пълна дължина в pcDNA6/V5-His (Invitrogen, Carlsbad, CA) се основават на GenBank NM 000280 (напред 5′-CCAGCCAGAGCCAGCATGCAG-3 ′, начален кодон в курсив; обратен 5′- TTACTGTAATCTTGGCCAGTATTGAGAC-3 ′, стоп кодон в курсив).

ДНК проучвания за свързване.

Приготвят се ядрени екстракти от INS1-E и COS-7 клетки и се извършват анализи на лентово преместване, както е описано (2). PAX6B протеинът е генериран с TNT T7 система за бързо свързване на транскрипция/транслация (Promega, Madison, WI). Използвани са конкурентни сонди при 30-кратен моларен излишък.

Уестърн блотинг.

Ядрените екстракти (10 μg протеин) или 2 μl от PAX6 in vitro транслация се отделят и се попиват при използване на стандартни процедури. Свързването на PAX6 антитяло (1: 5000) (PAX6-C20; Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) беше открито с помощта на конюгирани вторични антитела от конска пероксидаза (1: 50 000) и Pico-West субстрат (Pierce, Rockford, IL).

Клетъчна култура и трансфекция.

INS1-E клетки се култивират, както е описано (10). COS-7 клетки се култивират в DMEM, допълнен с 10% фетален говежди серум. Клетките бяха трансфектирани с UCP2 репортерни конструкции и постоянно количество от 1 μg ДНК чрез добавяне на PAX6 експресионни плазмиди или празен pcDNA6/V5-His плазмиден скелет (2).

Имунохистохимия.

INS1-E клетките бяха фиксирани, блокирани и оцветени с анти-PAX6-C20 (1: 400) и анти-инсулин (1: 2 000). Свързването се визуализира с TRITC- и FITC-свързани вторични антитела, като се използва конфокалната сканираща система MRC-600 (Bio-Rad, Hercules, CA).

FSIGT.

След еднодневно гладуване, игла беше поставена в предтекубиталната вена в 8:00 ч. Сутринта. Кръвни проби се събират на -10 и -1 минути преди глюкозен болус от 30 g да се приложи в контралатерална вена в нулево време. Кръвни проби се събират на 3, 4, 5, 6, 8, 10, 14, 19, 22, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 100, 140 и 180 минути.

Статистика.

Двупосочен ANOVA беше използван за сравняване на транс-активирането на варианта и дивия тип UCP2 промотор от PAX6A- и PAX6B-изоформи. Груповите разлики на непрекъснатите променливи бяха установени от ANOVA. Логаритмични трансформации бяха направени, ако бяха отхвърлени предположения за равна дисперсия и нормалност на ANOVA. Измерванията бяха коригирани чрез многократна регресия за ефекти от секс и ИТМ, както е посочено. За сравнение на категориалните променливи е използван тест за непредвидени обстоятелства χ 2.

Минималният модел на изчезване на глюкозата е изчислен, като се използват минималните модели SAAM II на системата глюкоза-инсулин, предоставени от Cobelli et al. (http://courses.washington.edu/rfka/minmod/manual.html) и софтуера SAAM II (SAAM Institute, Сиатъл, Вашингтон) (24).

Острият инсулинов отговор (AIR) към глюкозата се изчислява като площта над базалния и под кривата на нивото на инсулин в зависимост от времето между 3 и 5 минути след натоварването с глюкоза, като се използва трапецовидното правило. Индексът на инсулинова чувствителност (SI) и AIR се умножават, за да се получи индексът на разположение (16).

Тъй като проучванията върху животински модели (7-9) и нашите промоторни проучвания дават априорна хипотеза за асоцииране на -866 G/A генотипове с параметри на FSIGT модел, ние използвахме многовариантни регресионни модели с ефективност на глюкозата (SG), SI, AIR, или индексът на разположение като зависима променлива и генотип (дадени кодове от 0, 1 и 2 или 0, 1 и 1 съответно в адитивните или рецесивните модели) като независима променлива. Бяха направени корекции за възраст, пол, ИТМ, SG и SI, както е посочено. Резултатните променливи SG, SI и AIR обикновено не са разпределени и следователно логаритмично трансформирани за анализи.

Равновесието на Харди-Вайнберг беше тествано с помощта на χ 2 тест за добро състояние. Стойностите на Р за разликите в честотите на генотипа между пациенти със затлъстяване от диабет тип 2 и пациенти със затлъстяване са определени, като се използва х2 разпределение с 2 степени на свобода. За да се определят асоциациите на генотипове с диабет тип 2 сред затлъстели лица, съотношенията на шансовете с CI са оценени чрез логистичен регресионен анализ, както е описано (2).

Благодарности

Това проучване беше подкрепено от безвъзмездна помощ за биотехнологии от Бундесланд Залцбург, от Jubilæumsfondsprojekt no. 9364 от Oesterreichische Nationalbank и с безвъзмездна помощ от Medizinische Forschungsgesellschaft Salzburg.

Признава се техническата помощ на Д. Пихлер и С. Фелнер.

Бележки под линия

Адресирайте кореспонденцията и заявките за повторно отпечатване до д-р Волфганг Пач, катедра по лабораторна медицина, Landeskliniken Salzburg, Mullnerhauptstrasse 48, A-5020 Salzburg, Австрия. Имейл: w.patschlks.at .

Получено за публикуване на 7 юни 2002 г. и прието в преработен вид на 22 юли 2002 г.

Ф.К. и той. допринесе еднакво за тази работа.

Допълнителна информация за тази статия може да бъде намерена в онлайн приложение на http://diabetes.diabetesjournals.org.

AIR, остър инсулинов отговор; FSIGT, ​​често вземан тест за интравенозен глюкозен толеранс; SG, ефективност на глюкозата; SI, индекс на инсулинова чувствителност; UCP2, отделящ протеин 2.