Jie Jiang

1 Център за педиатрични изследвания на Херман Б Уелс, Медицински факултет на Университета в Индиана, Индианаполис, IN 46202, САЩ; ude.ui@51jj (J.J.); ude.ui@virsas (S.S.)

Санкалп Шривастава

1 Център за педиатрични изследвания на Херман Б Уелс, Медицински факултет на Университета в Индиана, Индианаполис, IN 46202, САЩ; ude.ui@51jj (J.J.); ude.ui@virsas (S.S.)

2 Катедра по биохимия и молекулярна биология, Медицински факултет на Университета в Индиана, Индианаполис, IN 46202, САЩ

Джи Джанг

1 Център за педиатрични изследвания на Херман Б Уелс, Медицински факултет на Университета в Индиана, Индианаполис, IN 46202, САЩ; ude.ui@51jj (J.J.); ude.ui@virsas (S.S.)

2 Катедра по биохимия и молекулярна биология, Медицински факултет на Университета в Индиана, Индианаполис, IN 46202, САЩ

Резюме

1. Въведение

Преди повече от половин век Хари Орел забеляза, че добавянето на глутамин на милимоларни нива в среда за култивиране на тъкани може силно да подобри клетъчния растеж и пролиферация [1]. Оттогава глутаминът се превърна в незаменим хранителен елемент в повечето съвременни среди за култивиране на тъкани. Причината, свързана с употребата на екзогенен глутамин, който обикновено е 5- до 20 пъти по-висок от която и да е друга отделна аминокиселина в тъканни култивиращи среди, е наскоро на фокус поради огромен напредък в областта на метаболизма на раковите клетки [ 2,3,4]. Сега е добре оценено, че глутаминът е универсален биосинтетичен субстрат за доставка на въглеродни и азотни атоми за генериране на важни предшественици за биосинтеза на макромолекули [5]. Тези важни предшественици включват нуклеотиди, несъществени аминокиселини (NEAA) и мастни киселини, които са съществени градивни елементи за нуклеиновите киселини, протеините и липидите съответно. В допълнение, глутаминът или метаболитите, получени от глутамин, могат да регулират производството на енергия, редокс контрола, генната транскрипция и вътреклетъчната сигнализация [6,7]. По този начин насочването на метаболизма на глутамин показа терапевтичен потенциал в предклинични условия чрез нарушаване на тези процеси, стимулиращи растежа [2].

2. Глутамин, универсален биосинтетичен субстрат

Глутаминът е NEAA, който може да бъде синтезиран de novo чрез използване на въглерод, получен от глюкоза и свободен амоний при бозайници. По този начин придобиването на глутамин чрез диета не е необходимо. Въпреки това глутаминът е една от най-разпространените аминокиселини в човешката плазма (0.5

прекъснете

Второ, глутаминът може да стимулира TCA цикъла и производството на АТФ. Една от причините, поради които раковите клетки разчитат на високи нива на екзогенен глутамин, е, че глутаминът може да се използва за подхранване на TCA цикъла чрез α-кетоглутарат, за да позволи по-нататъшното му окисление [13]. Показано е, че изчерпването на глутамин намалява съотношението NADH/NAD +, което инхибира консумацията на кислород и производството на АТФ [14]. По този начин, в допълнение към попълването на междинните продукти на TCA цикъла за биосинтез, непрекъснатото окисление на произведен от глутамин α-кетоглутарат чрез TCA цикъл също осигурява източник на енергия (Фигура 1 B).

3. Небиосинтетична роля на глутамина

4. Глутаминовото гладуване: експериментално състояние или патофизиологичен стрес?

Темите за глутаминовото гладуване бяха привлечени за първи път от диетолози, които забелязаха, че плазмените нива на глутамин намаляват значително по време на тежко нараняване [36]. Подобни явления се наблюдават по-късно при много други патологични състояния, които често са свързани с повишена катаболна активност, за да компенсират загубата на циркулиращ глутамин. Например, катаболизмът на мускулните протеини се използва за поддържане на плазмената концентрация на глутамин на по-ниско ниво по време на продължително гладуване [37]. При пациенти с рак, плазмената концентрация на глутамин също е намалена [38]. Смяташе се, че свързаните с тумори усложнения, като кахексия, може да са следствие от намалените концентрации на аминокиселини в кръвообращението. В резултат на това беше установено, че добавянето на глутамин в диетата намалява разграждането на мускулите и подобрява имунната функция при някои пациенти с рак, получаващи химиотерапия [39].

Като се има предвид факта, че раковите клетки увеличават консумацията на глутамин, за да подпомогнат биосинтезата, наблюдаваното намаляване на концентрацията на глутамин в кръвния поток на пациенти с рак поражда убеждението, че може да възникне ограничение на глутамин по време на прогресията на тумора. Всъщност нивата на глутамин в туморните тъкани или телесните течности около туморните тъкани са установени по-ниски от нормалните тъкани или плазма [8,9,10,40]. Освен това, неотдавнашната работа сочи, че дори в рамките на една и съща туморна тъкан, е установено, че глутаминът е допълнително изчерпан в ядрото на ксенографтните тумори в сравнение с периферията на туморите [23]. Този резултат е в съответствие с концепцията, че неадекватното съдово снабдяване с хранителни вещества остава бариера за натрупване на вътрешна туморна маса [41]. По този начин наскоро бяха положени големи усилия за разбиране на различни механизми, които туморните клетки използват, за да се адаптират към ограничаването на глутамина за по-нататъшното им развитие. Тези механизми включват медиирано от сигнала решение на съдбата на клетката, протеолитично отстраняване, засилена de novo биосинтеза на глутамин и пренареждане на използването на други хранителни вещества [5].

5. Влияние на други аминокиселини върху глутаминовия глад

Интересно е, че проучванията от последните пет години предполагат, че достъпността до други хранителни вещества, особено NEAA, може да повлияе дълбоко на реакциите на туморните клетки към глутаминовия глад [42,43,44,45,46,47]. Аспарагинът, аспартатът и аргининът демонстрират способността да предпазват туморните клетки от глутаминов глад или от блок на глутаминов катаболизъм; докато усвояването на цистин увеличава клетъчната чувствителност към тези смущения. В следващите няколко раздела ще обсъдим въздействието на всяка от тези констатации върху разбирането на метаболизма на глутамин, както и техните потенциални терапевтични приложения при рак.

5.1. Аспарагин

Тези две произведения показват, че повечето глутамин-зависими биосинтетични дейности все още могат да продължат, с изключение на производството на аспарагин, когато липсва екзогенен глутамин. В действителност, работата, извършена в ендотелните клетки, образуващи васкулатура и трансформираните фибробластни клетки, трансформирани от сарком на Капоши (KSHV), показва подобен ефект на аспарагина за подпомагане на оцеляването и пролиферацията на клетките след изчерпване на глутамина [48,49]. Важно е, че аспарагинът може да спаси индуциран от изчерпването на глутамин дефект на растежа в туморните клетки на гърдата при концентрации в рамките на физиологичния диапазон (25

100 μM) [44]. При този диапазон от концентрации никой от другите NEAA не може да спаси разпространението. Освен това, въвеждането на каталитично активна аспарагиназа, ензим за разграждане на аспарагин, от долните гръбначни животни в клетките на бозайници предотвратява способността на аспарагина да спасява глутаминовия глад при физиологични концентрации. Тъй като предполагаемата човешка аспарагиназа показва минимална активност на аспарагиназата [44], авторите предполагат еволюционен натиск, за да предизвикат селективна загуба на активността си в клетките на бозайници като средство за запазване на вътреклетъчния аспарагин с цел посредничество на клетъчната адаптация към патофизиологичните промени на нивата на глутамин в околната среда. [44].

Освен това, както глутаминът, също така беше установено, че вътреклетъчният аспарагин може да функционира като противоион за обмен на извънклетъчни EAA, за да поддържа mTORC1 активност [29,50]. Добавянето на аспарагин в DMEM среда, която не съдържа рутинно аспарагин, може да поддържа mTORC1 активност, която иначе се потиска след лишаване от глутамин [44]. Остава да се определи дали възстановяването на активността на mTORC1 чрез добавяне на аспарагин играе роля в растежа/оцеляването на туморните клетки по време на глутаминовото гладуване.

5.2. Аспартат и аргинин

Наскоро бе установено, че аргининът е в състояние да подпомогне адаптацията на туморните клетки към глутаминовото гладуване [46]. Показано е, че лишаването от глутамин индуцира експресията на аргининов транспортер SLC7A3 върху клетъчната повърхност по р53-зависим начин, за да улесни усвояването на аргинин. Следователно, вътреклетъчното натрупване на аргинин поддържа mTORC1 активиране и клетъчен растеж/пролиферация. Интересно е, че аргининът не допринася за TCA цикъла чрез превръщане на орнитин в глутамат или освобождаване на фумарат по време на цикъла на урея [46]. Дали може да подпомогне биосинтеза на други макромолекули по време на глутаминовото гладуване изисква по-нататъшно проучване.

5.3. Цистин

За разлика от аспарагина, аспартата и аргинина, беше установено, че цистинът повишава чувствителността на туморните клетки към инхибиране на глутамината, когато се допълва над физиологичните нива в среда за култивиране на тъкани [47]. Тъй като поглъщането на цистин през xCT транспортера използва глутамат като контра-йон в замяна, беше предложено, че обменът на цистин/глутамат създава зависимост от глутамината за поддържане на дезаминирането на глутамин и производството на глутамат [47]. Интерес представлява вносът на цистин като централен компонент на зависимата от глутамин/глутамат антиоксидативна защита [15]. Тези работи заедно могат да предполагат, че е необходим прецизен контрол на използването на глутамин за оптимизиран растеж на тумора, особено когато е нарушена екзогенната доставка на глутамин. Туморните клетки разчитат на глутамин, получен от глутамин, за обмен на цистин, който е основният източник на вътреклетъчен цистеин, NEAA за синтез на протеини и производство на глутатион; от друга страна, прекомерното усвояване на цистин може да причини изтощение на глутамат, като по този начин се предотврати по-нататъшното му използване през TCA цикъла или трансаминирането.

6. Какъв е критичният ограничаващ метаболит по време на глутаминовото гладуване?

Всички горепосочени резултати предполагат съществуването на цялостна програма за посредничество в адаптацията на туморните клетки към ограничаването на глутамина. Въпреки това, фактът, че повече от една аминокиселина може да промени отговорите на туморните клетки към глутаминовия глад или неговото катаболно инхибиране, създава предизвикателство за ефикасността на насочване на метаболизма на глутамин при рак. Очевиден въпрос, който може да възникне, е защо туморните клетки избират различни аминокиселини, за да модулират зависимостта си от екзогенен глутамин. Най-простият отговор е, че присъщото свойство на туморните клетки се различава. Тази специфичност може да бъде продиктувана от туморния произход, състоянието на онкоген/туморен супресор и микросредата на тумора. Например, може да се предскаже, че туморите със загуба на функция на p53 може да не са в състояние да се адаптират към глутаминовия глад чрез поглъщане на аспартат или аргинин. Необходими са допълнителни изследвания за разработването на допълнителни стратегии, които трябва да се комбинират при насочване на метаболизма на глутамин при рак.

Може обаче да се постави въпросът защо туморните клетки не могат просто да използват въглерод и азот, получени от глутамин, за да синтезират аспарагин чрез аспарагин синтетаза (ASNS), ензим, силно експресиран в солидни туморни клетки [51], ако самият глутамин не ограничава. Подсказка може да бъде намерена от скорошен доклад, показващ, че относителните разходи за биосинтетична енергия за аспарагин са най-високите сред деветте NEAA (Asn, Asp, Gln, Ser, Arg, Pro, Glu, Ala, Gly), които се синтезират от гликолиза и Извлечен от цикъла TCA източник на въглерод при хората [52]. Това е вероятно поради високите енергийни разходи за поддържане на въглеродния поток от глюкоза, за да премине през TCA цикъла, за да генерира глутамат, глутамин и аспартат, когато липсва екзогенен глутамин. Можем да предположим, че въпреки че туморните клетки експресират високи нива на ASNS, те не са в състояние да си дадат допълнителната енергия за производството на аспарагин. За отбелязване е, че самият глутамин е необходим за синтеза на протеини. В тази връзка аспарагинът улеснява синтеза на глутамин de novo чрез индукция след транскрипция на глутамин синтетаза (GLUL) по време на глутаминовото гладуване [44].

7. Ключови варианти, влияещи върху дефиницията на критично ограничаващия метаболит

Определянето на критично ограничаващия метаболит във всеки контекст не само ще изясни фундаменталната връзка между биохимията на метаболизма на глутамин и неговите биологични функции, но също така ще осигури нови метаболитни цели, които могат да бъдат инхибирани, за да се повиши ефикасността на насочване на метаболизма на глутамин при рак. За да се определи критичният ограничаващ метаболит обаче, трябва да се разгледат стриктно няколко фактора.

Първо, аминокиселинният състав в среда за култивиране на тъкани определя видовете глад. В обстановката на модифицираната среда на Dulbecco's Eagle’s (DMEM), която не съдържа екзогенен аспарагин и аспартат, се очаква лишаването от глутамин да причини вътреклетъчно изчерпване на поне тези три аминокиселини [42,44,46]. За разлика от тях, Medium 199 съдържа всички NEAA, с изключение на аспарагина, и по този начин лишаването от глутамин може да причини изчерпване на глутамин и аспарагин, но не и на аспартат [48]. По същия начин, в DMEM, допълнен с всички NEAA, лишаването от глутамин може да изчерпи само самия глутамин, освен ако поглъщането на аспартат не бъде блокирано [45]. В този случай поглъщането на прекомерен аспартат чрез неговия транспортер на клетъчната повърхност не само може да спаси зависимия от аспартат нуклеотид и синтез на протеини, но също така може да подпомогне попълването на междинните съединения на TCA цикъла, за да стимулира de novo биосинтеза на глутамин (Фигура 2 В).

Второ, лишаването от глутамин и инхибирането на глутаминазата могат да дефинират различни видове критично ограничаващ метаболит. В експериментални условия, при които екзогенният глутамин се изчерпва или намалява до ниско ниво, може да се предвиди, че всички зависими от глутамин клетъчни процеси са нарушени. Очаква се обаче инхибирането на глутаминазата да блокира превръщането на глутамин в глутамат и по-нататъшното му използване в TCA цикъла, производството на NEAA и биосинтеза на нуклеотиди. При тази обстановка самият вътреклетъчен глутамин и всякаква глутамин-зависима сигнализация за растеж/оцеляване не се ограничават. Фактът, че екзогенният аспартат спасява инхибирането на глутаминазата чрез синтез на нуклеотиди, но не и TCA цикъла и други NEAA, предполага, че тези метаболитни дейности могат да продължат, вероятно чрез използване на други източници на въглерод в среда за култивиране на тъкани [43] (Фигура 2 D). Трябва да се отбележи, че глутаминът също е незаменим източник на азот за нуклеотиден биосинтез независимо от аспартата (Фигура 1 А). Фактът, че самият глутамин е неограничен след инхибиране на глутаминазата, може да обясни защо тези клетки не се нуждаят от екзогенен аспартат, за да поддържат TCA цикъла, необходим процес за de novo биосинтеза на глутамин.

Трето, критичният ограничаващ метаболит, който е отговорен за клетъчната пролиферация и оцеляването, може да бъде различен при ограничение на глутамина. Тъй като клетъчната пролиферация изисква натрупване на биомаса, може да се предположи, че когато една аминокиселина може да спаси клетъчната пролиферация по време на лишаване от глутамин или инхибиране на глутаминазата, биосинтезата на всички макромолекули трябва да може да продължи (Фигура 2 B-D). В тази обстановка туморните клетки трябва да запазят способността си да придобиват достатъчно количество аминокиселини, включително аспарагин, аспартат, глутамат и самия глутамин за протеинов синтез. В допълнение, някои от тези аминокиселини трябва да се набавят на достатъчно нива, за да поддържат биосинтеза на други макромолекулни предшественици. Например, аспартатът и глутаминът са необходими предшественици за нуклеотидната биосинтеза. Въпреки това, в условията, когато една аминокиселина може да спаси само дефекта на оцеляване, като аргинин, биосинтезата на макромолекула не е необходима (Фигура 2 Д). Всъщност все още остава неуловимо кои са най-критичните ограничителни метаболити за оцеляването на клетките при различни видове метаболитен стрес. Смята се обаче, че промените в сигналните пътища, включващи чувствителност на хранителни вещества, реакция на стрес и апоптоза, са основните играчи [42,46,53].

8. Сложност на глутаминовото гладуване при тумори In Vivo

9. Терапевтично значение

10. Заключения

Благодарности

Благодарим на Мелиса Еванс за четенето на ръкописа.