Николай Медведев

1 Катедра по науки за живота и здравето, Отвореният университет, Милтън Кейнс MK7 6AA, Великобритания

Виктор Попов

1 Катедра по науки за живота и здравето, Отвореният университет, Милтън Кейнс MK7 6AA, Великобритания

2 Институт по клетъчна биофизика, Руска академия на науките, Пущино 142290, Русия

Кристиан Хенебергер

3 Институт по неврология, Университетски колеж в Лондон, Queen Square, Лондон WC1N 3BG, Великобритания

4 Институт за клетъчни неврологии, Медицински факултет на Университета в Бон, Бон, Германия

Игор Краев

1 Катедра по науки за живота и здравето, Отвореният университет, Милтън Кейнс MK7 6AA, Великобритания

Дмитрий А. Русаков

3 Институт по неврология, Университетски колеж в Лондон, Queen Square, Лондон WC1N 3BG, Великобритания

Майкъл Г. Стюарт

1 Катедра по науки за живота и здравето, Отвореният университет, Милтън Кейнс MK7 6AA, Великобритания

Свързани данни

Резюме

Тази статия изследва връзката между морфологичната модалност на 189 дендритни бодли и околните астроглии, използвайки пълни триизмерни реконструкции на невропилни фрагменти. Интегративна мярка за триизмерно глиално покритие потвърждава, че постсинаптичните плътности на тънкия гръбначен стълб са по-плътно заобиколени от глии. Това разграничение предполага, че зависимата от дифузия комуникация между синапси и глии близо до „обучаващи се“ синапси (свързани с тънки бодли) може да бъде по-силна от тази близо до синапсите на „паметта“ (свързана с по-големи бодли).

1. Въведение

В хипокампуса високоафинитетни транспортери, населяващи мембрани на астроглията, бързо буферират възбуждащия невротрансмитер глутамат, освободен от синаптични разряди [1–4]. Тази мощна поглъщаща система поддържа нисък външен външен клетъчен глутамат (20–30 nM), осигурявайки „безшумен“ фон за преходни възбуждащи сигнали [5]. Астроцитите обаче заемат по-малко от 10% от тъканния обем в областта CA1 на хипокампуса [6], а синхронните синаптични освобождавания могат да доведат до екстра- или междусинаптични действия на глутамата [7–9]. Всъщност астроцитните изпъкналости се срещат неравномерно в хипокампалния невропил, като се доближават едва до 20-30% от възбуждащите синапси [10], без видима връзка с морфологията на дендритните бодли на гостоприемника [11]. Глиалното покритие на синапсите обаче варира в зависимост от физиологичното състояние на организма [12,13], което повдига въпроса дали има адаптивно значение за неравномерното разпределение на астроглията в близост до хипокампалните синапси.

За да разследваме това, първо документирахме архитектониката и фракцията на тъканния обем, заети от живи астроцити в зъбния невропил, и, второ, реконструирахме в три измерения ултраструктурата на съседни фрагменти от астроцити заедно със съседните възбуждащи синапси. За да определим количествено съпоставянето на синапсите и астроглията, първо изчислихме най-късите разстояния между астроцитните мембрани и най-близките ръбове на постсинаптичните плътности (PSD) при 136 „тънки“ и 53 „гъбични“ дендритни бодли [14,15] от зъбни гранули. Второ, приложихме интегративна мярка за претеглено разстояние, предоставяща кумулативни данни за пространствено глиално покритие на PSD. Установихме, че глиалните мембрани се срещат значително по-близо до PSD на тънките дендритни бодли в сравнение с гъбните бодли. Тъй като гъбите и тънките дендритни бодли са свързани с различните доминиращи синаптични рецептори [16–18] и различни етапи на синаптична пластичност [19–21] (макар и вж. [22]), резултатите показват, че глията може селективно да се доближава до синапсите, които са в процеса на физиологично „учене“.

2. Материал и методи

а) Двуфотонна микроскопия и морфометрия

подхожда

(б) Подготовка и обработка на тъкани за електронна микроскопия

(в) Триизмерна реконструкция и морфометрия

Цифровите електронни микрографии (1200 dpi) бяха подравнени с помощта на SEM A lign 1.26 и контурите на отделни дендритни бодли, PSD и астроцитни процеси бяха проследени цифрово, използвайки IGL T раса 1.26 (http://www.synapses.clm.utexas.edu/). Дебелината на среза се определя, както е описано по-рано [26] и обикновено е 60–70 nm (сив/бял цвят). Обемите и повърхностите на отделните структури бяха изчислени и триизмерни (3D) обекти бяха генерирани с помощта на IGL T расата. Дендритните бодли, съседни на идентифицирани астроцитни процеси, бяха реконструирани и анализирани (вж. Резултатите). Допълнителни критерии за „гъбени“ бодли са присъствието на гръбначен апарат и сложен PSD (перфориран, U-образен или сегментиран), докато „тънките“ бодли имат само макуларни PSD и никакъв гръбначен апарат [27,28].

За измервания на разстояние използвахме реконструирани повърхности, представени от квази-правилни триъгълни решетки; решетъчните върхове предоставиха набор от повърхностни координати. Когато е необходимо, центроидите се изчисляват директно от такива набори. Преминаването и измерването на всички разстояния между PSD (всички повърхностни точки) и астроцитната мембрана (всички повърхностни точки с горна граница на разстоянието) се извършва в 3D, като се използва състезанието IGL T; метриката на разстоянието през цялото време е евклидова. Експортирахме 3D реконструкции към софтуера 3D-S tudio -M ax 8 за повърхностно изобразяване. S tatistica (StatSoft) се използва за статистически тестове. ANOVAs, последвани от тестове на Bonferroni или Tukey (неравномерни проби), бяха извършени с помощта на O rigin P ro v. 7.5.

3. Резултати

(а) Астроцити в зъбния гирус: обемна фракция на невропила в живата тъкан

Обемната фракция на тъканите, заета от глия, GV, трябва да отразява основните свойства на усвояването на глутамат в района. Досега GV е измерван във фиксирани препарати, използвайки стереологични правила [2,6]. За измерване на GV в жива тъкан, ние приложихме 2P микроскопия: 2P възбуждане възниква изцяло в около 1 µm дебел оптичен слой, гарантиращ, че не се генерира замърсяваща флуоресценция извън фокалната равнина. Тъй като глиалните изпъкналости обикновено са много по-тънки от полупрозрачния възбуждащ слой, извадената емисия F (i, j) (i и j, пикселни координати в равнината X – Y) е пропорционална на локалната обемна част на глията, изпълнена с индикатор, или GV (i, j).

За да преведем GV (i, j) в локалната обемна фракция, ние го свързахме с флуоресценцията Fmax (i, j) вътре в напълнената с боя клетъчна сома (т.е. 100% обемна част) в същата фокална равнина (фигура 1 c): GV (i, j) = (F (i, j) - F0)/(Fmax - F0), където F0 е фонова флуоресценция (извън всякакви оцветени структури). Използвахме този подход, за да получим две измервания. Първо, изключихме областите, заети от сома и дебели (над 1 µm) астроцитни процеси. Получената средна стойност (n = 10 клетки) по този начин отразява фракцията на тъканния обем, заета от фините глиални издатини. Важното е, че локалното е относително постоянно далеч от сомата (фигура 1 в), което предполага хомогенно глиално покритие в целия астроцитен домейн. Второ, измерихме стойността на GV, която включваше всички подобни на дендрита процеси: GV = 8,9 ± 0,7% (n = 10). Тази стойност трябва да съответства на наблюдения с електронна микроскопия, при които фрагменти от астроцитни процеси се вземат произволно. Тъй като хипокампалните астроцити са склонни да заемат отделни невропилни домейни, с малко или никакво пространствено припокриване [24,30,31], стойността на GV следователно трябва да осигури контрол за пълнотата на реконструкцията на астроглията на ниво електронна микроскопия.

(б) Пространствено съпоставяне на синапси и глии

В електронни микроснимки на сериен разрез на медиален молекулен слой (Материали и методи) идентифицирахме глиални фрагменти, използвайки критериите, описани по-рано [3,6,11,32], и допълнително потвърдихме това, като проследихме съседни структури в серията (фигура 2а; електронен допълнителен материал, фигура S2). В цялата проба средната фракция на обем на тъканите, заета от глия, е GV = 9,18 ± 0,65% (n = 16 астроцитни фрагмента). Това беше в отлично съгласие с GV, измерено в жива тъкан (виж по-горе), което показва точността на глиалната идентификация. След това реконструирахме фрагменти от астроцити заедно със съседните дендритни бодли, съдържащи PSD (фигура 2 b; електронен допълнителен материал, фигура S2).

Триизмерна реконструкция на съседни фрагменти от астроцити със съседни синапси. (a – d) Фрагмент от назъбен астроцит, реконструиран в три измерения (син, (a, b)) заедно със съседните дендритни бодли (сиви и тъмно жълти структури, (b)), снабдени с PSD (червено). Бодлите недвусмислено се разделят на подгрупи тънки (тъмно жълти, показани отделно в (в)) и гъби (сиви, (г)). Вижте електронния допълнителен материал, фигура S2, за примери за оригиналните серийни раздели с идентифицирани структури.

При 3D реконструкции бихме могли недвусмислено да разграничим тънки (n = 136) и гъбни (n = 53) дендритни бодли (фигура 2 c – d), които се различават повече от пет пъти в средния си обем на главата [14,21,25]. Всъщност средният обем на главата за гъби и тънки бодли е бил съответно 0,1998 ± 0,0156 и 0,0323 ± 0,0019 µm 3 (средно ± s.e.m.). Средно 3D разстояние от най-близкия съсед между PSD центроидите сред всички бодли е 0,57 ± 0,02 µm (n = 190). Това е в съответствие с обемната плътност на възбуждащите синапси в зъбната извивка [33,34] и подобно на средното междусинаптично разстояние на най-близкия съсед в зона CA1 [10,35]. Тази последователност допълнително потвърждава точността на процедурите за възстановяване.

Извлечение за финансиране

Тази работа беше подкрепена от BBSRC (BB/J021687/1), тръста на Wellcome Trust, Съвета за медицински изследвания (Великобритания), Европейския съюз (FP6 Promemoria 512012), ERC Advanced Grant, NRW-Rückkehrerprogramm, Human Frontiers Science Program (HFSP RGY-0084/2012) и стипендия за върхови постижения на UCL.