Тази статия има корекция. Моля виж:

Резюме

Въведение

Инсулиновата резистентност е основна метаболитна характеристика на затлъстяването и ключов фактор в патогенезата на диабет тип 2. Много редове доказателства показват, че активирането на провъзпалителни пътища в прицелните инсулинови тъкани може да наруши инсулиновата сигнализация, а хроничното възпаление на тъканите на ниско ниво е признато за важна причина за системна инсулинова резистентност (1). Няколко проучвания показват, че макрофагите, ключов компонент на вродената имунна защита срещу патогени, са критични ефекторни клетки в този възпалителен процес.

предотвратява

Макрофагите, присъстващи в невъзпалените тъкани (резидентни макрофаги), спомагат за поддържането на хомеостазата и участват в ремоделирането на тъканите (2). Въпреки това, при затлъстели състояния макрофагите се натрупват в мазнините, черния дроб и мускулните тъкани, отделяйки проинфламаторни цитокини като TNF-α и IL-6, които индуцират клетъчна инсулинова резистентност чрез активиране на JNK или IκB киназа β сигнализиране със сериново фосфорилиране на инсулиновия рецептор субстратни протеини. Доказано е, че макрофагите, които са новонабрани след излагане на диета с високо съдържание на мазнини (HFD), се различават от резидентните макрофаги в мастната тъкан, като показват повишени провоспалителни свойства (3). Въпреки че както вродената, така и адаптивната имунна система са замесени в активирането и набирането на макрофаги при затлъстяване (4), точните механизми, които регулират набирането на нови макрофаги в инсулиновите целеви тъкани, са неясни.

G-протеиновите рецептори (GPCRs) медиират различни физиологични функции, които поставят тези протеини като терапевтични цели при метаболитно заболяване. Те също са цел на приблизително половината от всички съвременни лекарствени лекарства (5). GPR105 (известен също като P2Y14 рецептор) е член на GPCR подгрупа, мощно активирана от пиримидин UDP-захари, особено уридин 5-дифосфоглюкоза (UDP-Glc) (6). GPR105 е широко експресиран в няколко човешки тъкани, включително плацентата, мастната тъкан, стомаха, червата и отделните мозъчни области (6). По-специално, GPR105 също се изразява на видно място в имунни клетки, включително макрофаги, лимфоцити и неутрофили (7-9). Предишни проучвания разкриха, че GPR105 регулира хемотаксиса на левкоцитите в отговор на UDP-Glc (10, 11).

Тъй като GPR105 участва в вродения имунен отговор, предположихме, че GPR105 може да допринесе за започване на индуцирана от затлъстяване инсулинова резистентност. В това проучване ние оценихме ефектите на специфичното делене на GPR105 за цялото тяло и костния мозък (официално име на гена: P2ry14) върху инсулиновото действие и хомеостазата на глюкозата. Ние показваме, че GPR105 в имунните клетки медиира набирането на макрофаги в черния дроб при хронично HFD хранене с последващо локално възпаление и инсулинова резистентност. По този начин GPR105 може да осигури нова връзка между вродения имунитет и инсулиновата резистентност.

Материали и методи

Животни

Метаболитни изследвания

Измервания на триглицериди и гликоген

Съдържанието на триглицериди (TG) беше измерено в чернодробни хомогенати в PBS, съдържащи 5% Triton X-100 и в плазмени проби (EnzyChrom, BioAssay Systems, Hayward, CA). Нивата на гликоген се измерват по метода на Seifter et al. (15).

Хистология

Оцветяването с H&E в чернодробни и мастни тъкани се провежда от Калифорнийския университет, хистологично ядро ​​в Сан Диего в Центъра за рак на Moore’s. Anti-Mac2 (Cedarlane Labs) и anti-F4/80 (Abcam, Cambridge, MA) Abs бяха използвани за имунохистохимия.

Имуноблот анализ

За стимулиран с инсулин анализ на фосфо-Akt, мишките са гладували в продължение на 7 часа и след това са инжектирани с 0,2 U/kg инсулин през долната куха вена под упойка. Тъкани бяха взети преди или след инжектиране (3 минути за черния дроб и 10 минути за епидидимална бяла мастна тъкан [eWAT] и скелетната мускулатура), щракащо замразени и подложени на Western blot анализи, извършени съгласно стандартни техники. Абс срещу p-Akt (Ser 473), Akt и α-тубулин са получени от Cell Signaling Technologies (Beverly, MA). За да измерим Akt фосфорилирането, ние имуноблотирахме солюбилизирани екстракти, съдържащи равни количества тъканни протеини със заешки поликлонални Abs срещу Akt или фосфо-Ser 473 Akt (Cell Signaling Technology, Beverly, MA), последвано от второ откриване на Ab. За количествено определяне относителните интензитети на протеиновите ленти бяха измерени с ImageJ и изразени като произволни единици.

Изолация на РНК и количествена RT-PCR

Обща РНК беше изолирана от клетки и тъкани с помощта на TRIzol Reagent (Invitrogen, Carlsbad, CA), съгласно инструкциите на производителя. СДНК от първа верига е синтезирана с помощта на комплект за обратна транскрипция на сДНК с голям капацитет (Applied Biosystems, Foster City, CA). Пробите се провеждат в 20-μl реакции, като се използва MJ Research PTC-200 96-ямков термоциклер, съчетан с четирицветна система за реално време Chromo 4 (GMI, Ramsey, MN). Нивата на генна експресия се изчисляват след нормализиране към стандартния домакински ген РНК полимераза II (RPII), използвайки ΔΔCT метода, както е описано по-горе (16). Последователностите на грундовете са налични в допълнителна таблица I.

Проследяване на моноцити

Кръв, събрана от ретро-орбиталния синус на WT или GPR105 KO мишки, беше подложена на RBC лизис, а подгрупите моноцити бяха обогатени с комплекта за обогатяване на моноцити на мишка EasySep (Stem Cell Technologies, Ванкувър, Британска Колумбия, Канада). Изолирани моноцити от 10–15 мишки от всеки генотип бяха събрани заедно. След това тези моноцити (5 × 10 5 до 10 × 10 5) се измиват в RPMI без серум и се суспендират в 2 ml разтворител C. PKH26 (Sigma-Aldrich, Сейнт Луис, МО), разтворени при 2 × 10 −3 М в разредител С се добавя и клетките се инкубират в продължение на 10 минути при стайна температура на тъмно. Реакцията на оцветяване се спира чрез добавяне на равен обем среда, допълнена с 10% FBS. Сместа се центрофугира и клетките се измиват веднъж и се суспендират отново в серум-съдържаща среда. След маркирането с PKH26, моноцитите бяха преброени и ~ 1 х 105 жизнеспособни клетки бяха суспендирани в 0.2 ml PBS и инжектирани във феморалната вена на WT мишки, които получават HFD. Пет дни след инжектирането, макрофаги на мастна тъкан (ATMs) и чернодробни непаренхимни клетки бяха изолирани и анализирани чрез FACS анализ.

FACS анализ на макрофаги от мастната стромална съдова фракция и черния дроб

Епидидималните мастни накладки се претеглят, изплакват се в PBS и след това се смилат в буфер FACS (PBS/1% BSA). Адипоцитите и стромалните съдови клетки са получени от смилана с колагеназа мастна тъкан (17). Клетките на чернодробните макрофаги се приготвят чрез двуетапно разграждане и фракциониране на чернодробна колагеназа върху градиент на плътността (18). Анализите на FACS на стромалните съдови клетки за съдържание на макрофаги и подтипове бяха извършени, както е описано по-рано (17). Abs, използвани за повърхностно оцветяване, са F4/80 (BM8), CD11b (M1/70) и CD11c (N418; eBioscience, Сан Диего, Калифорния).

Култура на макрофаги, получена от костен мозък и in vitro анализ на хемотаксис

Културата от макрофаги от костен мозък (BMDM) се извършва, както е описано по-рано (17). Накратко, клетките на костния мозък бяха промити от бедрените кости и пищялите на WT и GPR105 KO мишки на възраст от 10 до 12 седмици. След това клетките се диференцират в BMDM в среда RPMI, съдържаща rM-CSF, FBS с нисък ендотоксин и стрептомицин/пеницилин. Пет дни след диференциацията, клетките бяха събрани и суспендирани в DMEM с 1 g/l глюкоза. Анализът на in vitro хемотаксис се извършва, както е описано по-рано (19). Приблизително 105 клетки бяха засяти в горната камера на 8-μM поликарбонатен филтър (24-трансуелен формат; Corning, Lowell, MA) и DMEM с посочени концентрации на UDP-Glc беше поставен в долната камера. След 3 часа бяха преброени клетките, които бяха мигрирали в долната камера.

Измерване на нивата на UDP-глюкоза в плазмата

Плазмените проби се депротеинизират с 5% трихлороцетна киселина, последвано от екстракция и неутрализация на етилов етер. Съдържанието на UDP-Glc в екстрактите е количествено определено с помощта на анализа, който се основава на ензимно превръщане на [32 P] -пирофосфат (32 PPi) + UDP-глюкоза в [32 P] UTP + глюкоза-1 P, както е описано по-горе ( 20). Накратко, пробите бяха инкубирани в продължение на 1 h в присъствието на 1 U/ml UDP-Glc пирофосфорилаза от хлебна мая (Sigma) и 100 nM 0,1 μCi 32 PPi (Perkin Elmer). Инкубациите се прекратяват чрез добавяне на 0,5 mM PPi и последващо нагряване (2 минути при 95 ° С). Получените [32 P] видове се разделят чрез HPLC, чрез колона Nova-Pack C18 (Waters) и се определят количествено онлайн с Flo-One 500TR Radiomatic анализатор (Packard). Калибрационна крива с използване на известни количества UDP-глюкоза (Fluka) беше извършена паралелно.

Статистически анализ

Подобрена глюкозна хомеостаза на мишки, хранени с HFD с GPR105 KO. (A) Повишаване на телесното тегло на WT и GPR105 KO мишки при NC и HFD (n = 12 на група). (Б.) Прием на храна на WT и GPR105 KO мишки на HFD (n = 12). (° С) Изпитване на толерантност към глюкоза при NC и HFD мишки. Глюкоза (1 g/kg) се инжектира i.p. след 7-часов пост и се събира кръв от опашката за измерване на глюкозата (n = 8). (д) Нива на инсулин на гладно при WT и GPR105 KO мишки на NC и HFD (n = 8). (Е.) Остра секреция на инсулин, измерена при HFD-хранени мишки WT и GPR105 KO при базални (7 часа бързо) и 15 минути след перорално предизвикване на глюкоза (n = 8). (F) Тестване на инсулинова толерантност при HFD мишки. Интраперитонеален инсулин (0.6 U/kg) се инжектира на 7-часови гладуващи HFD WT и GPR105 KO мишки. Кръвната глюкоза се измерва в посочените часови точки. Всички стойности са изразени като средни стойности ± SEM. * p 473 фосфорилиране на Akt, както и общо Akt и HSP90 в черния дроб, мастната тъкан и скелетните мускули. Тъканите бяха събрани преди или в посоченото време след инжектиране на инсулин (0,2 U/kg) в долната куха вена.

Подобрена инсулинова чувствителност на мишки, хранени с HFD с GPR105 KO. In vivo инсулинова чувствителност, определена от хиперинсулинемично-евгликемична скоба при WT (n = 6) и GPR105 KO (n = 6) мишки, хранени с HFD. GIR (A), ГДР (Б.), IS-GDR (° С), базален и скоба HGP (д) и потискане на HGP (Е.) са представени като средни стойности ± SEM. * p 473 фосфорилиране на Akt, както и общо Akt и HSP90 в черния дроб, мастната тъкан и скелетните мускули. Тъканите бяха събрани преди или в посоченото време след инжектиране на инсулин (0,2 U/kg) в долната куха вена.

GPR105 KO мишките също демонстрираха значително по-ниски нива на HGP както при базални, така и в стационарни условия на захващане (фиг. 2D), което показва, че способността на инсулина да потиска HGP е повишена при HFD-хранени мишки GPR105 KO (фиг. 2Е). В съответствие с подобрената чернодробна и скелетна мускулна чувствителност към инсулин, открита в проучванията на скобите, фосфорилирането на AKT е значително повишено в чернодробните, мастните и скелетните мускулни тъкани на мишките GPR105 KO след инсулинова стимулация (фиг. 2F). Взети заедно, тези in vivo резултати подкрепят заключението, че GPR105 KO мишките показват подобрена системна инсулинова чувствителност след HFD с подобрено инсулиново действие в черния дроб, скелетните мускули и мастните тъкани.

Намалена чернодробна стеатоза и възпаление при GPR105 KO мишки

Чернодробните тегла бяха намалени при мишките GPR105 KO (фиг. 3А), въпреки сходните телесни тегла на мишките GPR105 KO и WT. Мишките GPR105 KO също демонстрират по-ниско съдържание на TG в черния дроб и гликоген (фиг. 3В, 3С), както и по-ниска степен на чернодробна стеатоза по хистология (фиг. 3D).

Намалена инфилтрация на макрофаги и възпаление в черния дроб. Тегло на черния дроб (A), TG (Б.) и съдържание на гликоген (° С) в черния дроб са представени като средства ± SEM. * p + клетка като процент от всички непаренхимни клетки чрез поточна цитометрия. * p + клетки от мишки GPR105 KO (фиг. 3G), в съответствие с намалено чернодробно възпаление. Освен това, генната експресия на няколко проинфламаторни цитокини (IL-1β, IL-10, IL-6 и TNF-a) беше дълбоко намалена в чернодробните тъкани от мишки GPR105 KO (фиг. 3Н). Трябва да се отбележи, че синтетазата на мастните киселини и ацетил КоА карбоксилазата бяха намалени, докато пероксизомален пролифератор-активиран рецептор α, ацил-КоА дехидрогеназа със средна верига, активиран пероксизомален пролифератор γ коактиватор-1β, митохондриален транскрипционен фактор А и субединица 2 на цитохрома оксидазата са увеличени (фиг. 3G), което предполага, че намалената липогенеза и повишеното окисление на мастните киселини могат да допринесат за подобрената чернодробна стеатоза, наблюдавана при мишки GPR105 KO.

Макрофаги в мастната тъкан. (A) eWAT тегло като процент от общото телесно тегло (n = 8). (Б.) Експресия на GPR105 в адипоцити и SVF клетки чрез количествена PCR. (° С) Представителни имунохистохимични изображения на eWAT, оцветени с анти-Mac2 Ab. Мащабни ленти, 100 μm. (д) F4/80 + CD11b + и (Е.) F4/80 + CD11b + CD11c + клетки в eWAT, измерени чрез поточна цитометрия (n = 6). (F) Експресия на гени в eWAT. Данните са представени като средни стойности ± SD. * p +, M1-подобни макрофаги показват, че секретират възпалителни цитокини, които намаляват инсулиновата чувствителност (17, 24). Въпреки че броят на чернодробните макрофаги е намален, имунохистохимичното оцветяване на епидидималната мастна тъкан с макрофагния маркер Mac2 не показва значителни разлики в короноподобните структури в мастната тъкан (фиг. 4С). По същия начин, поточната цитометрия не показва разлики нито в F4/80 + CD11b + (двойно положителни; фиг. 4D), нито в F4/80 + CD11b + CD11c + (тройно положителни) макрофаги (фиг. 4Е) в eWAT стромалните съдови фракция от GPR105 KO мишки. Също така не успяхме да открием значителни промени в провъзпалителната генна експресия. Въпреки че експресията на гена IL-1β намалява, подобни промени не се наблюдават в експресията на гена TNF-α и IL-6 (фиг. 4F).

Делецията на GPR105 намалява хемотаксиса на макрофагите in vivo и in vitro

Тъй като изчерпването на GPR105 води до намален брой на макрофагите в черния дроб, ние след това изследвахме дали това явление може да се отдаде на намалено набиране на макрофаги спрямо увеличения оборот на макрофагите. Затова проведохме експеримент за проследяване на моноцити in vivo, за да оценим способността на нулевите моноцити на WT или GPR105 да мигрират в черния дроб и мастните тъкани. Ние проверихме, че моноцитите съставляват> 90% от популацията на левкоцитите след обогатяване (допълнителна фигура 1). Белязани с PKH26 моноцити, изолирани от GPR105 KO или WT донорски мишки, се инжектират i.v. към WT реципиентни мишки на HFD. Пет дни след инжектирането, белязани с PKH26 клетки в непаренхимната клетъчна фракция бяха преброени чрез поточна цитометрия. По-рано показахме, че макрофагите представляват> 90% от белязаните с PKH клетки, наети към непаренхимната фракция както на черния дроб, така и на мастната тъкан (25).

Както е показано на Фиг. 5А, по-малко чернодробни PKH26 + моноцити са идентифицирани при мишки, които са получили GPR105 KO моноцити (Фиг. 5А). За разлика от това, процентът на клетките PKH26 + в мастната стромална съдова фракция не се различава между двете групи (фиг. 5В). Тези резултати показват, че GPR105 играе роля в реакцията на моноцитите към хемоаттрактните сигнали от черния дроб, но не и от мастната тъкан. Освен това, степента на намаляване на чернодробните PKH26 + клетки в GPR105 KO мишки предполага, че намаляването на чернодробните F4/80 + клетки (фиг. 3G) вероятно отразява разлика в набирането на макрофаги, а не на резидентните тъканни макрофаги (Kupffer клетки) в HFD- хранени GPR105 KO мишки.

Подобрена глюкозна хомеостаза и инсулинова чувствителност на мишки с трансплантиран костен мозък GPR105 KO. (A) Изпитване на толерантност към глюкоза при мишки WT-BMT и KO-BMT на NC или HFD (n = 12). * p 473 фосфорилиране на Akt и HSP90 в черния дроб, мастната тъкан и скелетните мускули на WT-BMT и KO-BMT. Тъканите се събират в посочените часове преди и след инжектиране на инсулин (0,2 U/kg). * p ATM макрофаг на мастна тъкан BMDM, получен от костен мозък, макрофаг BMT трансплантация на костен мозък eWAT епидидимална бяла мастна тъкан GDR скорост на изхвърляне на глюкоза GIR скорост на инфузия на глюкоза GPCR G протеин-свързан рецептор GTT глюкозен толеранс тест HFD диета с високо съдържание на мазнини HGP производство на чернодробна глюкоза IS- GDR инсулин-стимулиран GDR ITT тест за толерантност към инсулин KO нокаут NC нормален чау 32 PPi [32 P] -пирофосфат RHM вербуван чернодробен макрофаг TG триглицерид UDP-Glc уридин 5-дифосфоглюкоза WT див тип.