Клетъчна неврофизиология

Редактиран от
Франческо Моча

Университет в Павия, Италия

Прегледан от
Takumi Takizawa

Университет Гунма, Япония

Lei Liu

Университет на Флорида, САЩ

Принадлежностите на редактора и рецензенти са най-новите, предоставени в техните профили за проучване на Loop и може да не отразяват тяхното положение по време на прегледа.

ефекти

  • Изтеглете статия
    • Изтеглете PDF
    • ReadCube
    • EPUB
    • XML (NLM)
    • Допълнителни
      Материал
  • Цитат за износ
    • EndNote
    • Референтен мениджър
    • Прост ТЕКСТ файл
    • BibTex
СПОДЕЛИ НА

Оригинални изследвания СТАТИЯ

  • 1 Катедра по експериментална медицина - Секция по човешка физиология, Втори университет в Неапол, Неапол, Италия
  • 2 Катедра по медицина, Университет в Падуа, Падуа, Италия
  • 3 Катедра по биология, Университет в Неапол Федерико II, Неапол, Италия

Въведение

Затлъстяването и диабетът са основните причини за заболеваемост и смъртност в западния свят и могат да доведат до възпалителни реакции и оксидативен стрес в периферните тъкани (Hotamisligil, 2006). Няколко данни показват, че свързаните с прехранване заболявания също са свързани с възпаление и повишени нива на реактивни кислородни видове (ROS) в мозъка (Cai, 2009). Хипоталамусът е мозъчният регион, отговорен за различни метаболитни регулации и много заболявания, свързани с прехранване, са етиологично свързани с дерегулациите на хипоталамусните неврони, които са много уязвими към хранителния оксидативен стрес и възпаление (Cai, 2009). Доказано е, че прекомерното хранене може да активира IKKβ/NF-κB в медиобазалния регион на хипоталамуса, който е зоната, отчитаща хранителния статус и регулираща метаболизма (Zhang et al., 2008). IKKβ/NF-κB е главен превключвател и централен регулатор на вродения имунитет и свързаните с него функции. Някои проучвания предполагат, че IKKβ/NF-κB, като медиатор на метаболитно възпаление, може да представлява връзката между прекомерното хранене и дисфункциите на хипоталамусната сигнализация, които причиняват затлъстяване и свързаните с тях проблеми (Zhang et al., 2008).

Един от мощните контрарегулатори на възпалителните сигнални пътища е аденозин монофосфат-зависимата киназа (AMPK; Salt and Palmer, 2012; Hernández-Aguilera et al., 2013). AMPK, еволюционно запазена серин/треонин киназа, е хетеротримерен комплекс, образуван от каталитична α субединица и регулаторни β и γ субединици. Фосфорилирането на α субединицата, в Thr172, превръща AMPK в активирана форма pAMPK. AMPK е сензор за клетъчно енергийно състояние, който, когато се активира от метаболитен стрес, е в състояние да поддържа хомеостазата на клетъчната енергия чрез включване по катаболни пътища (Hardie, 2014).

Няколко проучвания демонстрират, че AMPK в хифоталамуса регулира приема на храна и че неговата активност се модулира от няколко хормона като лептин, адипонектин и инсулин. Тъй като тези хормони участват в контрола на телесното тегло и метаболизма на глюкозата и липидите, тези открития предполагат, че AMPK може да служи като ефектор надолу по веригата на лептин и инсулин и по този начин да играе роля като сигнална молекула по време на метаболитни реакции, предизвикани от хормони. Докато лептинът инхибира AMPK активността в дъгообразните и в паравентрикуларните ядра на хипоталамуса, инсулинът е известен с това, че инхибира AMPK активността в страничните, вентромедиалните и дорзомедиалните хипоталамусни области (Minokoshi et al., 2004). Всички тези мозъчни региони участват в контрола на приема на храна (Monda et al., 1993; Viggiano et al., 2006) и в енергийните разходи (Monda et al., 1996; Messina et al., 2013).

Полиненаситените мастни киселини ω-3 (PUFA), докозахексаеновата киселина (DHA) и ейкозапентаеновата киселина (EPA) са диетични съединения, които интензивно се изучават като мощни противовъзпалителни продукти, способни да намалят риска от инсулинова резистентност и да подобрят свързаното със затлъстяването нарушения, засягащи хормоналния контрол и модулиращи активността на AMPK (Xue et al., 2012; Martínez-Fernández et al., 2015). Наскоро демонстрирахме, че заместването на свинска мас, богата на наситени мастни киселини (SFA), с рибено масло (богато на ω-3 PUFA) при диета с високо съдържание на мазнини (HFD) е в състояние да ограничи развитието на системно и тъканно възпаление, чернодробна стеатоза и за намаляване на инсулиновата резистентност (Lionetti et al., 2014a, b; Cavaliere et al., 2016).

Тук тествахме на ниво хипоталамус ефекта на заместване на наситени с ненаситени мастни киселини върху AMPK, активиран AMPK (pAMPK при Thr 172), IKKβ, възпаление и оксидативен стрес. Нещо повече, ние също анализирахме при същите животни участието на инсулин, лептин и възпалителни параметри в модулацията на AMPK.

Материали и методи

Всички химикали са закупени от Sigma – Aldrich (Сейнт Луис, Мисури, САЩ), освен ако не е посочено друго. Млади мъжки плъхове Wistar (на 60 дни; 345 ± 7 g; Charles River, Calco, Lecco, Италия) бяха индивидуално поставени в клетка в контролирана от температурата стая и изложени на ежедневен цикъл 12/12 h светлина/тъмнина със свободен достъп до чау диета и питейна вода. Плъховете бяха разделени на три експериментални групи (н = 8) според различен 6-седмичен хранителен режим: първата група (контролна диета, CD) е получила стандартна диета (10,6% мазнини J/J); втората група (LD) получи HFD, богата на свинска мас (40% мазнини J/J); и третата група (FD) получи HFD, богата на рибено масло (40% мазнини J/J). Съставът на всички диетични режими е представен в таблица 1.

Таблица 1. Състав на диетата.

През целия експериментален период телесното тегло и приема на храна се наблюдават ежедневно, за да се изчисли наддаването на телесно тегло и брутният енергиен прием. Разлятата храна се събира и компенсира при пренастройване на изчислението на приема на храна. Брутната енергийна плътност за стандарт или HFD (съответно 15,8 или 20 kJ/g) се определя от бомбен калориметър (Parr адиабатичен калориметър, Parr Istrumentes Co, Moline, IL, САЩ).

Друг набор от CD, LD и FD животни (н = 5 на група) на 6 седмици от лечението са инжектирани i.p. с инсулин (хомолог бързодействащ, 10 единици/kg телесно тегло; Novartis, Базел, Швейцария).

В края на експерименталните лечения плъховете се анестезират чрез i.p. инжекция на хлоралхидрат (40 mg/100 g телесно тегло), обезглавена с гилотина и кръвта е взета от долната куха вена. Хипоталамусът бързо се дисектира от мозъка и се прехвърля в подходящия буфер. Всички проби, които не бяха използвани веднага, се съхраняват при -80 ° C.

Параметри на серума

Серумните нива на холестерол, триглицериди, NEFA и глюкоза се измерват със стандартни процедури. Серумните нива на инсулин (Mercodia AB, Упсала, Швеция), TNF-α (Biovendor R&D, Бърно, Чехия), адипонектин и лептин (B-Bridge International Mountain View, Калифорния, САЩ) бяха измерени с помощта на наличните в търговската мрежа комплекти ELISA.

Анализ на липидната пероксидация

За да се определи липидната пероксидация в хипоталамовия хомогенат, нивото на малондиалдехид (MDA) беше измерено с помощта на метода на реакцията на тиобарбитурова киселина (TBAR). MDA реагира с тиобарбитурова киселина (TBA), за да образува розов хромоген, който се открива при дължина на вълната 532. Стойностите на MDA са изразени като наномоли на милиграм мозъчен протеин (Lu et al., 2009).

Редукционен статус и активирани ензимни фактори, свързани с еритроид 2 (Nrf2) Дейности, активирани

Намалените концентрации на глутатион (γ-L-глутамил-L-цистеинил-глицин, GSH) и окислени концентрации на глутатион (γ-глутамил-L-цитенил-глицин дисулфид, GSSG) в хипоталамуса бяха измерени с помощта на дитионитробензоена киселина (DTNB) (Bergamo et al., 2007); съотношението GSH/GSSG се използва като маркер за оксидативен стрес. Ензимните активности на глутатион S-трансфераза (GST) и NAD (P) H-хинон оксидоредуктаза (NQO1) бяха оценени спектрофотометрично в мозъчни цитоплазмени екстракти със стандартни протоколи (Benson et al., 1980; Levine et al., 1990).

Западно петно

Хипоталамусът се хомогенизира в лизисния буфер (10 mM HEPES, 10 mM KCl, 1,5 mM MgCl2, 12% глицерол, 0,5 mM DTT, 0,1 mM EGTA) с коктейл от протеазни инхибитори (Sigma Aldrich). Протеините (20 или 40 μg/лента) се разделят на 12% SDS-PAGE и се прехвърлят в нитроцелулозни мембрани. Петните бяха инкубирани с AMPKα заешко моноклонално антитяло (Cell Signaling Technology; dil 1: 1000), pAMPKα (Thr172) заешко моноклонално антитяло (Cell Signaling Technology; dil 1: 1000), IKK-β заешко моноклонално антитяло (Abcam; dil 1: 500) или α-тубулиново мише антитяло (Sigma Aldrich; dil 1: 1000) за една нощ при 4 ° C и след това с вторично антитяло срещу заешки или миши IgG (Promega; dil 1: 2500) за 1 h при RT. Сигналите са визуализирани с ECL системата (Pierce). Нивото на експресия на α-тубулин е използвано за нормализиране на данните.

Статистически анализ

Статистическите анализи бяха проведени с помощта на SPSS 13.0 (SPSS Inc., Чикаго, IL, САЩ). ANCOVA или еднопосочен ANOVA, последван от Tukey’s post hoc тестът е използван за оценка на разликите между групите. P стойности по-малки от 0,05 се считат за статистически значими.

Декларация за етика

Процедурите, включващи животни и грижата за тях, са проведени в съответствие с международното и националното законодателство и политики (Директива 2010/63/ЕС на ЕС за опити с животни, насоки ARRIVE и декларацията от Базел, включително концепцията 3R). Процедурите, докладвани тук, бяха одобрени от Институционалния комитет по етика на опитите с животни (CSV) на Университета в Неапол Федерико II и от Ministero della Salute.

Резултати

Ефект от диета с високо съдържание на мазнини, обогатена със свинска мас или рибено масло върху наддаването на телесно тегло и приема на енергия

Фигура 1 отчита промените в телесното тегло, дневната консумация на храна (g/ден) и енергийния прием при плъхове, хранени с LD или FD, в сравнение с CD на 1-6 седмици лечение. Във всеки момент от време телесното тегло е било по-високо при LD в сравнение с CD, но разликата е била статистически значима само след 5 и 6 седмици лечение (Фигура 1А). От друга страна, трите групи плъхове не показват никаква разлика в дневната консумация на храна (g/диета, Фигура 1В). като има предвид, че енергийният прием (kJ/диета) е бил значително по-висок в LD и FD групите в сравнение с CD групата във всеки момент от времето (Фигура 1C).

Фигура 1. Ефект на диета с високо съдържание на мазнини, обогатена със свинска мас или рибено масло върху телесното тегло, консумацията на храна и енергийния прием. Телесно тегло (А), консумация на храна (Б) и дневен енергиен прием (° С) по време на 6 седмично лечение с контролна диета (CD), обогатена с рибено масло диета (FD) или диета, обогатена с мас (LD). Стойностите са изразени като Средно ± SEM. # P Ключови думи: диета с високо съдържание на мазнини, ω3-PUFA, AMPK, възпаление, оксидативен стрес

Цитиране: Viggiano E, Mollica MP, Lionetti L, Cavaliere G, Trinchese G, De Filippo C, Chieffi S, Gaita M, Barletta A, De Luca B, Crispino M и Monda M (2016) Ефекти от обогатена диета с високо съдържание на мазнини в свинска мас или във рибено масло върху хипоталамусната усилена протеинова киназа и възпалителни медиатори. Отпред. Клетка. Невроски. 10: 150. doi: 10.3389/fncel.2016.00150

Получено: 08 март 2016 г .; Приет: 27 май 2016 г .;
Публикувано: 09 юни 2016 г.

Франческо Моча, Университет в Павия, Италия

Takumi Takizawa, Университет Gunma, Япония
Lei Liu, Университет на Флорида, САЩ

* Кореспонденция: Мариана Криспино, [email protected]

Тези автори са допринесли еднакво за тази работа и споделят първото авторство.