Хепатит В вирус X протеин предизвиква чернодробна стеатоза чрез засилване на експресията на свързващ черния дроб мастнокиселинен протеин

РЕЗЮМЕ

ВАЖНОСТ Натрупващи се данни от епидемиологични и експериментални проучвания показват, че хроничната HBV инфекция е свързана с чернодробна стеатоза. Въпреки това, молекулярният механизъм, лежащ в основата на индуцирана от HBV патогенеза на чернодробна стеатоза, все още предстои да бъде изяснен. В това проучване установихме, че експресията на чернодробно свързващ протеин с мастни киселини (FABP1) е драстично увеличена в серумите на HBV-инфектирани пациенти и в серумите и в чернодробните тъкани на HBV-трансгенни мишки. Принудителната експресия на HBx доведе до регулиране на FABP1, докато нокдаунът на FABP1 значително намали натрупването на липиди както в моделите in vitro, така и in vivo. Възможно е HBx да насърчава натрупването на чернодробни липиди чрез регулиране на FABP1 в развитието на HBV-индуцирана безалкохолна мастна чернодробна болест. Следователно инхибирането на FABP1 може да има терапевтична стойност при свързана със стеатоза хронична HBV инфекция.

ВЪВЕДЕНИЕ

Инфекцията с вируса на хепатит В (HBV) е сериозен здравословен проблем в световен мащаб, причиняващ остър и хроничен хепатит, цироза и хепатоцелуларен карцином (1). Появяващите се данни от епидемиологични и експериментални проучвания показват, че хроничната HBV инфекция, както и HCV инфекцията, са свързани с чернодробна стеатоза (2, 3). Честотата на чернодробната стеатоза при пациенти с хронична HBV инфекция варира от 27 до 51% (4). Освен това е известно, че HBV X протеинът (HBx) причинява чернодробно отлагане на липиди, като инхибира секрецията на аполипопротеин В (5). Предишен доклад показа, че увеличената експресия на HBx може да причини натрупване на липиди в хепатоцитите, вероятно медиирана от стерол регулаторен елемент, свързващ протеин 1 и активиран от пероксизома пролифератор рецептор γ (PPARγ) (4) Молекулярният механизъм, чрез който HBV индуцира патогенезата на чернодробната стеатоза, остава неуловим. Използвайки флуоресцентна двумерна диференциална гел електрофореза и матрично подпомагана лазерна десорбционна йонизация – време на анализ на масова спектрометрия на полета, установихме, че нивото на протеин на свързващия протеин на мастните киселини в черния дроб (L-FABP или FABP1) в HBV-продуциращите клетки е значително увеличено в сравнение с това в контролните клетки (6).

Като се има предвид ключовата роля на FABP1 в липидния метаболизъм и неговото потенциално влияние върху метаболитните нарушения и факта, че субектите с хронична HBV инфекция често развиват чернодробна стеатоза, ние се опитахме да определим дали FABP1 участва в свързана с HBV чернодробна стеатоза и да изследваме молекулярния механизъм отговорен за регулирането на FABP1 от HBx.

МАТЕРИАЛИ И МЕТОДИ

Клетъчни линии и пациенти. HepG2 (HB-8065; American Type Culture Collection [ATCC], Manassas, VA), Huh7 (JCRB0403; Япония) и Hep3B (HB-8064; ATCC) клетки се поддържат в модифицирана от Dulbecco среда Eagle (DMEM; Invitrogen, Carlsbad, CA), допълнен с 10% (обем/обем) фетален говежди серум (FBS) (Invitrogen). HepG2.2.15 клетки (CRL-11997; ATCC), съдържащи четири копия на HBV-DNA, бяха култивирани в модифицирана среда на Eagle (Invitrogen) с G418 (Invitrogen) при 380 μg/ml. HepG2-HBV3 клетъчна линия, съдържаща 1,2 единични дължини на генома на HBV и контролна HepG2-RepSal1 клетъчна линия (6) се поддържат в DMEM, допълнена с 10% FBS и хигромицин В (Roche Diagnostics, GmbH, Манхайм, Германия) при 250 μg/ml.

Общо 150 пациенти с хроничен хепатит В са събрани от болницата за инфекциозни болести във Фуджоу за откриване на FABP1 в серума чрез ензимно-свързан имуносорбентен анализ (ELISA). Тези пациенти са положителни за HBsAg, HBeAg, анти-HBc и HBV-специфична ДНК в серума. Количественото вирусно натоварване на HBV се определя чрез използване на диагностичен комплект за HBV (Abbott Laboratories, Чикаго, IL) в съответствие с инструкциите на производителя. Не са прилагани антивирусни лекарства преди вземането на кръвни проби. Като контроли бяха получени общо 30 нормални не-HBV-заразени серума. Клиничният раздел на изследването е прегледан и етично одобрен от Институционалния комитет по етика на Медицинския университет Фуджиан (Фуджоу, Китай). Всички пациенти са дали информирано и писмено съгласие.

Плазмиди, олигонуклеотидна siRNA трансфекция и генериране на рекомбинантни аденовируси и лентивируси. pGL3B-255, pGL3B-255HNF3βmut и pGL3B-255C/EBPαmut са конструирани, както е описано по-рано (21). pGL3B-255PPARαmut и pGL3B-255mut (които включват мутации на тройно свързващо място за HNF3β, C/EBPα и PPARα) са синтезирани химически от Sangon Biotech (Шанхай, Китай). HNF3β и C/EBPα малки интерфериращи РНК (siRNAs) са описани в по-ранното ни проучване (21). Смес от PPARα siRNA и смес от FABP1 siRNA са получени от биотехнологията Santa Cruz и като отрицателна контрола (NC) е използвана нецелева siRNA. pRep-HBV (съдържащ 1,2 единици дължина на генома на HBV) и контролен плазмид pRep-Sal са описани по-рано (6). Мутационният плазмид pRep-HBV-X (-), който съдържа стоп кодон при HBx кодон 8 (CAA до UAA), е генериран чрез специфична за мястото мутагенеза, както е описано по-горе (22). ДНК трансфекцията се извършва с помощта на Lipofectamine 2000 (Invitrogen), а siRNA трансфекциите се извършват с използване на Lipofectamine RNAiMAX (Invitrogen).

HBx-свръхекспресиращият аденовирус (Ad-HBx) и празният контрол (Ad-GFP) бяха генерирани с помощта на системата AdEasy XL (Stratagene, CA), както описахме по-рано (23). HepG2, Huh7 и Hep3B клетки бяха засяти в шест ямкови плаки с плътност 5 × 10 5 на гнездо и заразени с рекомбинантни аденовируси при множественост на инфекцията (MOI) съответно 10, 100 или 200 или посочените дози. . Супернатантите на клетъчните култури се събират и клетките се събират на 72 h след инфекция. Рекомбинантен лентивирус LV-FABP1-shRNA, съдържащ къса шпилка РНК (shRNA) срещу мишка FABP1, е конструиран от GeneChem Co., Ltd. (Шанхай, Китай), целевата последователност е 5'-GTCAGAAATCGTGCATGAA-3 '. Лентивирусите с отрицателен контрол LV-GFP са предоставени от GeneChem.

Експерименти с животни. В това проучване са използвани мъжки, съответстващи на възрастта (на възраст от 6 до 8 седмици) HBV (HBV-Tg) или HBx +/– трансгенни мишки (HBx-Tg) и техните диви (WT) носители (24). Мишките бяха настанени в помещения с контролирана влажност и температура, със свободен достъп до храна и вода. Индуцираните със затлъстяване мишки с високо съдържание на мазнини (HFD) получават HFD (Diet Research, USA) за 8 седмици, докато контролните мишки са хранени с нормална диета (ND). Контролният лентивирус (LV-GFP) или LV-FABP1-shRNA рекомбинантен лентивирус (5 × 10 7 инфекциозни лентивирусни частици на мишка) бяха доставени чрез хидродинамично инжектиране на опашна вена на мишки (25). Кръвни проби бяха получени чрез сърдечна пункция по време на жертвоприношение. Чернодробният индекс се изчислява като мокро тегло на черния дроб/телесно тегло. Чернодробните тъкани се екстрахират, незабавно замразяват с помощта на течен азот и се съхраняват при -80 ° C, докато се анализират. Проучването върху животни е одобрено от Институционалния комитет по грижа и употреба на животните в Медицинския университет на Фуджиан (IACUC). Номерът на протокола IACUC за изследването е M00186.

In vitro модел на клетъчна стеатоза. Натриев палмитат (каталожен номер P9767) и натриев олеат (каталожен номер O7501) са получени от Sigma-Aldrich (Сейнт Луис, МО). Индукцията на клетките с претоварване с мазнини се извършва главно по предварително установени методи (26), където HepG2 клетки при 80% сливане са били изложени на наситени (палмитат) и ненаситени (олеат) дълговерижни свободни мастни киселини (FFA) смеси в съотношение от 2: 1. Като контрола се използва безмастен киселинен говежди серумен албумин (BSA). За да се оцени влиянието на нокауда на FABP1 върху клетъчната стеатоза, клетките се третират със смес от FFA след 48 h трансфекция на siRNA-FABP1. След инкубация със сместа FFA, клетъчното натрупване на липиди беше измерено с оцветяване с масло-червено-O и нивото на триглицеридите.

Определяне на клетъчното съдържание на мазнини и нивото на триглицеридите. Маслено-червено-оцветяване се извършва на чернодробни секции и клетки HepG2, като се използват стандартни процедури, както е описано по-горе (27). Съдържанието на триглицериди се определя с помощта на наличен в търговската мрежа комплект (Sigma-Aldrich) в съответствие с инструкциите на производителя и се нормализира до съдържанието на протеин чрез BCA анализ (Pierce, Rockford, IL).

Чернодробна морфология. Чернодробните тъкани бяха фиксирани в 4% формалин и вградени в парафин съгласно стандартните методи. Вградените в парафин тъкани бяха разрязани (5 μm) и оцветени с хематоксилин и еозин (H&E) за морфологичен анализ.

qPCR и Western blot анализ. Общата РНК и протеин са извлечени от HepG2 клетъчни лизати или чернодробни тъкани на мишки за анализ на генната експресия.

qPCR беше извършен с PCI система в реално време ABI StepOne (Applied Biosystems, Foster City, CA) и комплект SYBR Premix Ex Taq (TaKaRa) в съответствие с инструкциите на производителя. GAPDH (глицералдехид-3-фосфат дехидрогеназа) служи като вътрешен контрол. Използваните правни и реверсивни грундове бяха 5′-CAAGTTCACCATCACCGCTG-3 ′ и 5′-ATTATGTCGCCGTTGAGTTCG-3 ′ за FABP1 и 5′-TGCACCACCAACTGCTTAGC-3 ′ и 5′-AGCTCAGGGATGACCTTGGDG.

Анализът на Western blot беше извършен с използване на анти-FABP1 (разреждане 1: 1000, HPA028275; Sigma), анти-Flag M2 (разреждане 1: 1000; Sigma), анти-HNF3β (sc-6554; разреждане 1: 500; Santa Cruz Biotechnology, Санта Круз, Калифорния), анти-C/EBPα (sc-61, разреждане 1: 500; биотехнология на Санта Круз), анти-PPARα (sc-9000; биотехнология Санта Круз) или анти-β-актин (разреждане 1: 4000); Sigma) и след това се сондира с конюгирана с алкална фосфатаза (AP) подходящо вторично антитяло и детекция на хемилуминесценция. Имунореактивните протеинови ленти се визуализират чрез добавяне на CDP STAR реагенти (Roche). Интензитетите на лентовите сигнали се определят количествено с помощта на денситометричния софтуер Quantity One (Bio-Rad, Hercules, CA).

Анализ на луцифераза. HepG2 клетки бяха поставени в 12-гнездна културна плака и преходно котрансфектирани с 0.2 μg промоторни репортерни плазмиди или pGL3-Basic (Promega, Madison, WI)/гнездо и 0.1 μg от pRL-TK плазмид (Promega), съдържащ Renilla луцифераза ген, използван за вътрешно нормализиране/кладенче. След 48 часа клетките се събират и се използват общо 20 μg клетъчен лизат за откриване на вътреклетъчна луциферазна активност, съгласно препоръките на Promega Corporation. Измерването на луминесценцията се извършва на луминометър (микропланшетен луминометър Orion II; Berthold Detection Systems, Германия). Всички анализи бяха проведени поне в три екземпляра.

Анализ на коимунопреципитация. Лизатите от HepG2 клетки се имунопреципитират с анти-FLAG M2 агароза (Sigma) или HNF3β, C/EBPα и PPARα антитела и протеин A/G агароза (Santa Cruz Biotechnology) при 4 ° C за една нощ. Имунните комплекси се елуират и се подлагат на Western blot анализ със съответните антитела.

CHIP анализ. Анализът на хроматин имунопреципитация (ChIP) се извършва съгласно протокола X-ChIP на Abcam. За имунопреципитация, ултразвуковите клетъчни лизати се инкубират с анти-HNF3β, анти-C/EBPα, анти-PPARα или анти-Flag M2 (същото количество нормален IgG като контрола) антитела за откриване на свързване с протеин-ДНК. Свързаните прицелни ДНК фракции се анализират чрез PCR с сдвоените праймери 5′-CATTTCGTGGGGTGCGGAGA-3 (смисъл) и 5′-AAGAACAGGATGGGCACAGC-3 ′ (антисенс), които усилват региона от нуклеотиди −136 до −251 (област 1 [R1] ), съдържащи места за свързване на HNF3β и C/EBPα, и сдвоените праймери 5′-GCTGTGCCCATCCTGTTCTT-3 ′ (смисъл) и 5′-GGGGCTCCCTTCCCTTCGAA-3 ′ (антисенс), които усилват региона от нуклеотиди −36 до −155 ( [R2]), съдържащи места за свързване на PPARα. Отдалечен 5 'нетранслиран регион (-4723 до -4460, регион 3 [R3]) на гена FABP1 се усилва като отрицателна контрола с праймерите 5'-TCTCACCCTCACCCTCAACT-3' (смисъл) и 5'-AATGCCCACCAACAGTAGACT-3 ′ (Антисенс).

ELISA. Количествата на FABP1, налични в HBV-инфектиран серум или в не-HBV-инфектиран серум, се определят с помощта на анти-човешки FABP1 ELISA комплект (GWB-HFABP1; GeneWay Biotech, Inc., Сан Диего, Калифорния) или специфична анти-мишка FABP1 ELISA комплект (RFBP10; R&D системи) в съответствие с инструкциите на производителя.

FABP1 медиира индуцирана от HBx чернодробна стеатоза in vivo. (А) Представителни флуоресцентни изображения на черен дроб, инфектиран с LV-FABP1-shRNA, експресиращ FABP1-GFP и контролиращ лентивирус LV-GFP. (B) Нивото на FABP1 протеин се определя чрез Western blot. (В) Представителни чернодробни изображения на мишки с посочените лечения. (D и E) Чернодробно тегло и нива на чернодробни триглицериди. (F) Представителни изображения на чернодробни секции от третирани мишки, оцветени с помощта на H&E и Oil-Red-O. Капките показват неутрално натрупване на липиди в H&E оцветяване. Червеното оцветяване показва неутрален липид при оцветяването с масло-червено-о. Стойностите представляват средни стойности ± SD (n = 5 за всяка група). *, P Получено на 11 октомври 2015 г.