• Намерете този автор в Google Scholar
  • Намерете този автор в PubMed
  • Потърсете този автор на този сайт
  • За кореспонденция: [email protected]

РЕЗЮМЕ

Обективен Степента на епидемия от наднормено тегло и затлъстяване се е увеличила значително през последните няколко десетилетия и 34% от възрастните и 15-20% от децата и юношите в Съединените щати вече са със затлъстяване. Меланокортиновият рецептор 4 (MC4R) допринася за контрола на апетита в хипоталамусните неврони и е цел за бъдещи лечения срещу затлъстяване (като сетмеланотид) или нови усилия за разработване на лекарства. Правилната регулация на трафика на MC4R в хипоталамусните неврони е от решаващо значение за нормалния невронен контрол на хомеостазата и се променя при затлъстяване и в присъствието на липиди. Механизмите, залегнали в основата на променения трафик на MC4R в контекста на затлъстяването, все още не са ясни. Тук открихме, че C2CD5, експресиран в хипоталамуса, участва в регулирането на MC4R ендоцитозата. Това проучване разкрива нов трафик протеин, регулиран хранително в хипоталамуса, предоставящ нова цел за зависими от MC4R пътища, участващи в хомеостазата на телесното тегло и затлъстяването.

участващ

Методи За да оценим експресията на C2cd5, за първи път използвахме in situ хибридизация и технология RNAscope в комбинация с електронна микроскопия. За in vivo характеризирахме енергийния баланс на мишки от див тип (WT) и C2CD5 за цялото тяло (C2CD5KO), хранени с нормална чау (NC) и/или западна диета (с високо съдържание на мазнини/с висока захароза/холестерол) (WD ). За тази цел направихме изчерпателна надлъжна оценка на телесното тегло, енергийния баланс (прием на храна, разход на енергия, двигателна активност с помощта на метаболитни клетки на TSE) и глюкозна хомеостаза. В допълнение, ние оценихме последицата от загубата на C2CD5 върху промени в поведението при хранене, обикновено предизвикани от инжектирането на агонист на MC4R (Melanotan, MTII) в паравентрикуларния хипоталамус (PVH). За подхода in vitro, ние разясняваме ролята на C2CD5 и неговия калциев чувствителен домейн C2 в трафика на MC4R. Ние се фокусирахме върху ендоцитозата на MC4R, използвайки експеримент за хранене с антитела (в невронална клетъчна линия - Neuro2A (N2A), стабилно експресиращ HA-MC4R-GFP; срещу HA-tag и анализиран чрез поточна цитометрия).

Резултати Установихме, че 1) експресията на хипоталамусния C2CD5 е намалена при индуцирани от диетата модели на затлъстяване в сравнение с контролите, 2) мишки без C2CD5 показват увеличение на приема на храна в сравнение с WT мишки, 3) C2CD5 взаимодейства с ендоцитозна машина в хипоталамуса, 4) загуба на функционален C2CD5 (липсва C2 домейн) притъпява MC4R ендоцитозата in vitro и увеличава MC4R на повърхността, която не реагира на MC4R лиганда, и, 5) C2CD5KO мишки проявяват намален остър отговор на инжектиране на MTII в PVH.

Заключения Въз основа на тях заключаваме, че хипоталамусният C2CD5 участва в MC4R ендоцитозата и регулира хомеостазата с телесно тегло. Тези проучвания показват, че C2CD5 представлява нов протеин, регулиран от метаболитни сигнали и участващ в ендоцитозата на метаболитните рецептори. C2CD5 представлява нова цел и път, който може да бъде насочен при затлъстяване.

1. Въведение

Един от първите гени на меланокортинова система, изследвани с използване на генетична делеция при мишки, беше MC4R, G-протеин-свързан рецептор. Нарушаването на MC4R при мишки доведе до затлъстяване, което подчертава потенциалната роля на MC4R при затлъстяване [15,16]. Мутациите в MC4R са сравнително честа причина за тежко затлъстяване [17,18,19,20]. Хората с MC4R мутации доведоха или до печалба [21], или до загуба на функция [17,18]. Предполага се, че много от тези мутации причиняват или задържане на мутиралите рецептори вътреклетъчно, което води до загуба на агонистичен отговор [22,23], или променена интернализация или рециклиране [21,24].

MC4R агонистите намаляват приема на храна и BW [25]. Забележително е, че последните фаза 3 проучвания на setmelanotide, агонист на MC4R, при пациенти със затлъстяване са постигнали своите първични крайни точки, за да го пуснат на пазара през 2020 г. Сред участниците, които са достигнали прага за отслабване след 12 седмици, средното намаляване на тялото тегло по време на изпитването е 25,4%. Съобщава се за спад на глада с 27,8% при тези участници. Много настоящи клинични проучвания целят намаляване на приема на храна и се насочват към сигнализиране и трафик на MC4R. От решаващо значение е да се разбере невробиологията, в основата на лекарствените ефекти, и да се дефинират по-добре MC4R активирането и колоезденето. В това проучване ние идентифицираме нов протеин за трафик на MC4R, който може да бъде насочен при затлъстяване.

От известно време е известно, че хиперкалоричните диети, съдържащи наситени мастни киселини, предизвикват инсулинова и лептинова резистентност, загуба на изобилие на MC4R лиганд α-MSH), стрес на ендоплазмен ретикулум и възпаление [24]. Предишни проучвания показват, че по време на липидния стрес MC4R интернализацията към ендозоми, както и насочването на рецептора към лизозомите е нарушена, което води до променена десенсибилизация [24]. Специфични протеини като MRAP, участващи в трафика на MC4R към плазмената мембрана, са били широко проучени [26,27]. Човешка мутация, която може да повлияе на ендоцитозата или рециклирането на MC4R [21], наскоро беше доказано, че влияе на хомеостазата с телесно тегло, но специфичните протеини, участващи в процеса на ендоцитоза/рециклиране на MC4R, все още не са идентифицирани.

Тук идентифицираме свързващ с калций и липиди С2 домен протеин, C2CD5 [28], които допринасят за регулирането на MC4R ендоцитозата. C2CD5 е силно експресиран в хипоталамуса и нивото му намалява при затлъстяване и в присъствието на наситени мастни киселини. Нашите данни показват, че хипоталамусният C2CD5 е нов протеин за трафик на рецептори, който реагира на метаболитни сигнали и участва в невронния контрол на енергийния баланс.

2. Материали и методи

2.1. Грижи и употреба на животните

Всички проучвания са проведени в съответствие с препоръките в Ръководството за грижа и използване на лабораторни животни от Националния здравен институт и одобрението на Институционалния комитет по грижа и употреба на животните в Университета Лойола. C57BL/6J (# 000664) са получени от лабораторията на Джексън (Мейн, САЩ) и C2CD5KO са получени от Тексаския институт за геномна медицина A&M (College Station, Тексас). Мишки с идентичен генетичен произход бяха сравнени във всички проучвания. Мишките бяха генотипирани и нокаутът на протеините беше оценен с помощта на имуноблоти (допълнително 2). Всички мишки бяха настанени 4/клетка при 12:12 h цикъл светлина/тъмнина. Мишките получават или NC (Teklad LM-485), или WD (TD88137, Teklad Diets; 42% ккал от мазнини, 34% тегловни захароза и 0,2% общ холестерол) (Envigo, Индиана, САЩ) в продължение на 12 седмици след първоначалната оценка на енергиен баланс и глюкозна хомеостаза преди дивергенция на BW (

седмица 7-8 години). BW се записват всяка седмица от отбиването. Всички споменати метаболитни проучвания са направени с помощта на мъжки и женски мишки с експериментатор, заслепен както за лечение, така и за генотип, като се използват насоките ARRIVE.

2.2. Клетъчна култура

N2A клетки, стабилно трансфектирани с HA-MC4R-GFP (любезно предоставени от д-р Giulia Baldini), се култивират в DMEM с L-глутамин и натриев пируват, допълнени с 10% FBS и пеницилин/стрептомицин. Клетките N2A, стабилно експресиращи HA-MC4R-GFP, са описани по-рано [29].

2.3. Тестове за глюкоза и инсулинов толеранс

Тестовете за толерантност към глюкоза и инсулин са извършени, както е описано по-горе [30,31,32]. За толерантност към глюкозата, през нощта (12 часа) на гладни мишки се дава i.p доза глюкоза (1g/kg BW) след измерване на нивата на глюкоза на гладно. След това нивата на кръвната глюкоза се проследяват на 15, 30, 60, 120 минути след инжектирането с помощта на AlphaTrak глюкомер за гризачи (Fisher Scientific, Пенсилвания, САЩ). За толерантност към инсулин, мишките бяха на гладно в продължение на 4 часа и им се дава i.p доза инсулин (0.5U/kg телесно тегло, Human-R Insulin U100, Lilly) с нива на глюкоза, контролирани преди и след, както е описано по-горе.

2.4. Уестърн блотинг

Хипоталамусът или изолирането на протеини от цели клетки и вестерното попиване се извършват, както е описано по-горе [30]. Накратко бяха изолирани цели клетки или хипоталамус, хомогенизирани в ледено буфер за лизис (1XPBS + 1% Triton X-100 + 0,01% SDS + инхибитор на протеаза/фосфатаза). Равният протеин беше зареден и разделен с помощта на 4–15% Mini-PROTEAN сглобяеми протеинови гелове (Bio-Rad, # 4561086) и прехвърлени върху PVDF мембрани (Bio-Rad) и обработени за актин (abcam, # ab8226), HA ( Biolegend, # 901513) и, C2CD5 (# A301-469A, Bethyl laboratories, Montgomery, TX) при разреждания, препоръчани от доставчика. Имуноблотите се анализират с помощта на ImageJ и се нормализират до нивата на актин и се графицират с помощта на контролни групи като 100%.

2.5. Анализ на метаболитна клетка

Метаболитните измервания бяха извършени с помощта на TSE Phenomaster (TSE системи, Chesterfield, MO) върху мишки WT и C2CD5KO преди BW дивергенция, за да се избегнат объркващи ефекти на BW върху енергийния баланс [33] и както е описано по-горе [31]. Параметрите на енергийния баланс също бяха оценени в метаболитните клетки, използвайки парадигма за хранене по двойки преди отклоняване на BW.

2.6. Имунопреципитация

За идентифициране на протеини, които взаимодействат с C2CD5, бяха използвани хипоталамус от 10-седмични мъжки WT мишки. Хипоталамите се хомогенизират и се определят нивата на протеин (BCA комплект за анализ на протеин, Thermo Fisher, # 23235). Петстотин микрограма протеин се инкубират с 1 μg заешко поликлонално анти-C2CD5 антитяло (Бетил лаборатории, # A301-469A) и се завъртат една нощ при 4 ° С. Пробите за една нощ бяха инкубирани с 25 μl протеинови A/G магнитни топчета (Thermo Fisher, # 88803), въртящи се в продължение на 4 часа при 4 ° C. Протеините се елуират от зърната с 50 μl лизисен буфер, съдържащ β-меркаптоетанол и се анализират с помощта на масова спектрометрия, както е описано по-долу.

За изследване на комплекса, съдържащ C2CD5, AP2 и HA-MC4R-GFP в N2A клетки, са използвани co-IP експериментални условия, използващи анти-C2CD5 или anti-HA (1: 150, Biolegend, # 901513), както е описано по-горе.

2.7. Протеомика и MS анализ

За C2CD5 IP, гел ленти/ленти бяха изрязани, почистени, оцветени и подложени на трипсипно разграждане в гела. Получените пептиди се пропускат през LC-MS/MS. Файловете с необработени данни бяха обработени и изчислени количествено с търсения, извършени срещу базата данни UniProt, с помощта на софтуера PEAKS с белтъчна оценка на доверието -10 lgP повече от 20, считани за висока степен на доверие.

2.8. ДНК конструкции

СДНК клон с пълна дължина на човешки KIAA0528 (присъединителен № BC117143) е получен от Dharmacon Research, Inc с IMAGE клон ID 40125694. Клонът е предоставен във pCR4-TOPO вектор. Мутантите на C2CD5-mCherry и ΔC2, са направени чрез PCR-базирана сайт-насочена мутагенеза са описани по-долу и ДНК последователностите за всички експресионни конструкции са потвърдени преди използване в експресионните изследвания и са валидирани за протеинова експресия с помощта на имуноблотинг. За да се получи експресионен вектор на C2CD5-ΔC2, първите 405 нуклеотиди бяха отстранени от 5 'края на cDNA C2CD5 с помощта на рестрикционни ензими Mlu1 (MCS) и Cla1 (405) и беше използван полилинкер за лигиране на останалата cDNA в десния пламък към pCMV5 вектор. За да се експресира C2CD5 с пълна дължина, слят с mCherry в неговия С-край, стоп кодонът преди мястото на BamH1 беше отстранен с помощта на PCR-базирана мутагенеза и cDNA лигирана в pcDNA3-mCherry вектор в местата Mlu1 и BamHI.

2.9. Стереотаксична хирургия

Извършени са стереотаксични операции за хронично имплантиране на водещи канюли (Plastics One Inc., Roanoke, VA, USA), насочени към PVH. Мишките бяха обезболени с използване на изофлуран и монтирани на стереотаксичен апарат с атравматични ушни пръти (Stoelting Co., Wood Dale, Илинойс). За PVH бяха използвани следните координати, получени от Paxinos, George & Franklin, Keith BJ (Мозък на мишката в стереотаксични координати, 2001): предна-задна, -0,55 mm; медиално-странично, -0,2 мм; гръбначно-вентрална, -4,6 mm и инжекционна игла с проекция 0 mm.

2.10. Лечение с Melanotan II (MTII)

След възстановяване от стереотаксична хирургия, метаболитните параметри бяха измерени при WT и C2CD5KO мишки. Мишките бяха микроинжектирани или с носител, aCSF (Harvard Apparat, # 59-7316) или MCR агонист, MTII (30 pmoles/200nL) (Phoenix Pharmaceuticals, Вирджиния, САЩ, # 043-29) в продължение на 30sec; иглата беше оставена на място за допълнителни 10-15 секунди, за да сведе до минимум потенциалния поток нагоре по следата на канюлата. Оценява се и въздействието на MCR агонист върху приема на храна. За това мишките бяха лишени от храна за една нощ (

16 часа) преди микроинжектиране с MTII или aCSF, за да се установи намаляване на приема на храна. След микроинжекциите мишките бяха поставени обратно в метаболитните клетки. Приемът на храна се определя на 2, 4, 6, 12, 24 и 48 часа след инжектирането, както е описано по-горе. Бяха направени и измервания на BW. Изследването се повтаря след 4-дневен период, така че на всяка мишка се инжектират aCSF и MTII (подредени в баланс), за да се осигури достатъчно време за измиване, за да се предотвратят остатъчни лекарствени ефекти. Всяка възможна променливост в ефективността на хранене поради малки разлики в BW в рамките на групата се отчита чрез дизайна на повтарящите се мерки и чрез измерване на ефектите на aCSF и MTII в рамките на същите мишки.

2.11. In situ хибридизация

Флуоресценция in situ хибридизация (FISH) се извършва върху 20 μm дебели парчета прясно замразени мозъчни мишки, като се използват флуоресцентни мултиплексни реагенти с RNAscope (Advanced Cell Diagnostics, 320850) в съответствие с инструкциите на производителя. РНК сонди за C2cd5 и Mc4r (Advanced Cell Diagnostics, съответно 436771 и 319181-C3) бяха инкубирани с мозъчните резени и усилването на сигнала беше постигнато с помощта на мултиплексните реагенти, както е указано. Изображенията са заснети с помощта на обърнат микроскоп Olympus IX80, оборудван с флуоресцентен източник на светлина X-Cite 120Q (Lumen Dynamics) и CD камера CoolSNAP HQ2 (Photometrics). Обработката на изображения и количественото определяне на РНК сигнала са направени с помощта на софтуера CellSens (Olympus Corporation, Waltham, Massachusetts).

2.12. Определяне на HA-MC4R-GFP на клетъчната повърхност чрез поточна цитометрия

Общият MC4R, присъстващ на клетъчната повърхност, се определя чрез поточна цитометрия, използвайки LSRFortessa (BD Biosciences, Сан Хосе, Калифорния). Накратко, клетките N2A (HA-MC4R-GFP) бяха трансфектирани или с C2CD5-mCherry, или с ΔC2-C2CD5-mCherry, като се използва реагент за трансфекция на Continuum (Gemini Bio, # 400-700). Трансфектираните клетки се третират с BSA без FFA или палмитат (200 цМ) в продължение на 18 часа. Живите клетки се промиват с пълна среда и се инкубират с анти-HA антитяло (1: 500, Biolegend, # 901513) в продължение на 2 часа при 4 ° С преди фиксирането. Наличието на HA-MC4R-GFP на клетъчната повърхност се използва, използвайки конюгирано антитяло Alexa 647 в непроменени условия. Общата клетъчна HA-MC4R-GFP се определя количествено чрез измерване на интензивността на GFP флуоресценция. За да се определи фракцията от общия рецептор, пребиваващ на клетъчната повърхност, съотношението HA-MC4R-GFP на клетъчната повърхност (Alexa 647 флуоресценция)/общ рецептор (GFP флуоресценция) се определя количествено за всяко състояние.

За да се изследва ефектът на α-MSH върху количеството MC4R на клетъчната повърхност, N2A клетки от горните групи се инкубират за 1 час при 37 ° C с DMEM, съдържащ 100 цМ циклохексимид, за да инхибират протеиновия синтез. След това клетките се инкубират в непрекъснато присъствие на циклохексимид със или без 100 пМ а-MSH за 30, 60 и 120 минути. Клетките се фиксират и клетъчната повърхност MC4R се измерва, както е описано по-горе.

2.13. cAMP анализ

N2A клетките от споменатите по-горе условия се третират с DMEM, съдържащ 0.5 mM IBMX за 10 минути при 37 ° С и след това се стимулират с 0.5 mM IBMX и 200 пМ MTII за 15 минути при 37 ° С. Пробите бяха събрани в 0.1M HCl, съдържаща 0.5mM IBMX, центрофугирани и анализирани съгласно инструкциите на производителя (Enzo Life Sciences). Събраните супернатанти в 0.1 М НС1 също се използват за определяне на концентрацията на протеин с помощта на BCA протеинов анализ.

2.14. ИмуноЕМ

Процедурите за подготовка на мозъчна тъкан за електронна микроскопия са модифицирани от Figge et al., 2013 и Yi et al., 2001 [34,35]. Накратко, WT мишките бяха дълбоко анестезирани с изофлуран и транскардиално перфузирани с 10 ml PBS, последвано от 100 ml PB, съдържащ 2% параформалдехид (Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA), 2,5% глутаралдехид (Electron Microscopy Sciences) и 0,01% калций получени са хлоридни и коронални сечения през ростро-каудалната степен на хипоталамуса. Изображенията са получени с електронен микроскоп за предаване Philips CM120 с (TSS Microscopy, Beaverton, OR), оборудван с 16-мегапикселова цифрова камера BioSprint (Advanced Microscopy Techniques, Woburn, MA).

2.15. TIRF микроскопия

За клетъчно изобразяване е използван Apo TIRF 60 × 1,49 обектив с матрична апертура с дълбочина на проникване около 100 nm. N2A клетките бяха трансфектирани или с плазмид, съдържащ само mCherry, или ΔC2-C2CD5-mCherry, както е описано по-горе в 35-милиметрови съдове със стъклено дъно (MatTak Corp, Ashland, Massachusetts). Идентифицирани са положително трансфектирани N2A клетки и трафикът на MC4R към зоната TIRF (GFP puncta) се записва на всеки 5 минути за период от 30 минути с помощта на микроскоп Nikon Eclipse-Ti TIRF и инкубационна система, поддържана при 37 ° C.

2.16. Количествено определяне и статистически анализ

Всички данни са представени като Средно ± S.E.M. Анализът беше направен с помощта на IBM SPSS Statistics 24. За сравнения с единични групи беше използван 1-или 2-опашен t-тест, както беше подходящо, и бяха извършени множество сравнения, използвайки ANOVA. За повторни измервания се използва двупосочен ANOVA и р стойност по-малка от 0,05 се счита за значима.

3. Резултати и дискусия

3.1. Експресия на C2CD5 в мозъка

Преди това беше показано, че C2CD5 участва в трафика на GLUT4 в адипоцити [28] и в инсулиновата чувствителност и покафеняване на мастната тъкан [36]. Досега експресията и функцията на C2CD5 в мозъка не са докладвани. В настоящото изследване показваме за първи път наличието на C2cd5 иРНК в мозъка, използвайки in situ хибридизация (Фигура 1А). Резултатите от in situ показват изразена експресия в мозъка с високо присъствие в хипоталамуса (Фигура 1A1). Наблюдавахме, че нивата на тРНК и протеините на C2CD5 са намалени в хипоталамуса на модела на затлъстяване, индуциран от западната диета, и ex vivo органотипни хипоталамусни култури, третирани с наситени мастни киселини (Фигура 1B-E). Тези данни предполагат роля на C2CD5 в хипоталамусните центрове. Направихме имуно-електронна микроскопия с висока разделителна способност, за да визуализираме клетъчната локализация на C2CD5 в хипоталамуса. Имуноголовото маркиране на хипоталамусната тъкан показва наличието на C2CD5 близо до плазмената мембрана и с митохондриална мембрана (Фигура 1F).