Концептуализация на роли, Куриране на данни, Формален анализ, Придобиване на финансиране, Разследване, Методология, Администриране на проекти, Ресурси, Софтуер, Надзор, Проверка, Визуализация, Писане - оригинален проект, Писане - преглед и редактиране

подобрява

Партньорски център за рибарство, аквакултури и водни науки, Училище за биологични науки, Университет на Южен Илинойс-Карбондейл, Карбондейл, Илинойс, Съединени американски щати

Роли Концептуализация, разследване, методология, администриране на проекти, писане - преглед и редактиране

Партньорски център за рибарство, аквакултури и водни науки, Училище за биологични науки, Университет на Южен Илинойс-Карбондейл, Карбондейл, Илинойс, Съединени американски щати

Роли Формален анализ

Отделение за биотехнологии и науки за живота, Университет на Инсубрия, Варезе, Италия

Роли Куриране на данни, формален анализ, писане - преглед и редактиране

Отдел за биологични науки, Университет на Южен Илинойс-Edwardsville, Edwardsville, Илинойс, Съединени американски щати

Роли Куриране на данни, формален анализ, писане - преглед и редактиране

Партньорски център за рибарство, аквакултури и водни науки, Училище за биологични науки, Университет на Южен Илинойс-Карбондейл, Карбондейл, Илинойс, Съединени американски щати

Роли Куриране на данни, формален анализ, писане - преглед и редактиране

Отделение за биотехнологии и науки за живота, Университет на Инсубрия, Варезе, Италия

  • Каролина Квасек,
  • Михал Войно,
  • Федерика Янини,
  • Vance J. McCracken,
  • Джовани С. Молинари,
  • Генциана Терова

Фигури

Резюме

Цитат: Kwasek K, Wojno M, Iannini F, McCracken VJ, Molinari GS, Terova G (2020) Хранителното програмиране подобрява използването на диетични растителни протеини при рибите зебра Danio rerio. PLoS ONE 15 (3): e0225917. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0225917

Редактор: Хуан Дж. Лоор, Университет на Илинойс, САЩ

Получено: 12 ноември 2019 г .; Прието: 20 февруари 2020 г .; Публикувано: 6 март 2020 г.

Наличност на данни: Всички релевантни данни са в ръкописа и неговите поддържащи информационни файлове.

Финансиране: Авторите не са получили конкретно финансиране за тази работа.

Конкуриращи се интереси: Авторите са декларирали, че не съществуват конкуриращи се интереси.

Въведение

Заместването на рибното брашно (FM) в рибните диети с растителен протеин (PP) е постоянно предизвикателство в индустрията на аквакултурите. Висококачествени PP източници като соеви или грахови протеинови концентрати и пшеничен или царевичен глутен са широко използвани от фуражната индустрия, тъй като тяхната усвояемост при някои видове е сравнима с FM. Цената им обаче често може да надвишава цената на морските суровини. Въпреки че е постигнат известен напредък с използването на по-нискокачествени РР, като соевото брашно, все още трябва да се преодолеят редица опасения, включително наличие на анти-хранителни фактори, отговорни за предизвикване на чревни възпаления, за поддържане на приемливи темпове на растеж и ефективност на фуража стойности при високи нива на заместване на FM.

Материали и методи

Изпитанието за хранене е проведено в Центъра за рибарство, аквакултури и водни науки към Университета на Южен Илинойс-Карбондейл (SIUC), IL. Всички експерименти бяха проведени в строго съответствие с препоръките в Ръководството за грижа и използване на лабораторни животни на SIUC. SIUC институционалните грижи и употреба на животните одобриха всички извършени протоколи (протокол № 18–007). По време на работа с риба анестезията се извършва с помощта на потапяне във водна баня в трикаин метансулфонат (MS222) с препоръчителна концентрация и се полагат всички усилия за минимизиране на болката, стреса и дискомфорта при животните.

Експериментални риби

Експериментът е проведен с данио, тъй като той се счита за утвърден модел на различни изследователски области, включително генетика, хранене, биомедицина и токсикология; освен това популярността му сега нараства в областта на научните изследвания в областта на аквакултурите [16]. Това е всеяден вид телеост, който може ефективно да използва както растителни, така и животински протеинови източници за растеж, служейки като чудесен модел за оценка на хранителните пътища при месоядни и тревопасни видове аквакултури [16].

Всички експерименти бяха проведени с помощта на рециркулирана система за аквакултури (Pentair Aquatic Eco-systems, Cary, NC), състояща се от биофилтър, въглероден филтър, UV светлина и функция за автоматично регулиране на pH/проводимост. Експерименталната културна система използва обратна осмоза като основен воден източник, където рН и проводимостта се поддържат на оптимални нива съответно от 6,9 ± 0,2 и 1584 ± 27 μS. Средната температура на водата по време на изпитването за хранене е била 27,1 ± 0,2 ° C. Фотопериодът се състоеше от 14 часа тъмнина и 10 часа светлина, с включени светлини от 8: 00–18: 00.

Разплодът на Zebrafish е получен от местен магазин за домашни любимци (Petco, Carbondale, IL). Мъжките и женските са били държани в отделни резервоари и хранени 2-3 пъти на ден с търговски фураж (Otohime, Япония) и Artemia nauuplii в продължение на две седмици преди размножаването. Рибите се комбинират за разплод в съотношение 2: 1 между женските и мъжките. В размножителния резервоар с изкуствени растения се поставя телена мрежа с 1,5 mm отвор за предизвикване на хвърляне на хайвера. Рибите бяха оставени да се размножават за 24 часа. След това разплодът беше премахнат след хвърляне на хайвера на следващия ден. Телената мрежа беше извадена и яйцата се излюпиха приблизително 48 часа при 27 ° C. На 3 дни след излюпването (dph) след отваряне на устата и когато ларвите започнаха активно да плуват, те бяха разпределени на случаен принцип в експериментални резервоари.

Зебрафите са били хранени с ротификатори Brachionus plicatilis само през първите два дни след етапа на плуване (3–4 dph). Ротификаторите са получени от кисти, закупени от търговски доставчик (Brine Shrimp Direct, Ogden, Юта). Започвайки с 5 dph, всички риби получават Artemia nauuplii, получени от излюпване на кисти от търговски източник (GSL Brine Shrimp, Ogden, Utah), заедно с ротифери (5–7 dph) и след това Artemia nauuplii само от 8–13 dph. Всички групи са били хранени ad libitum по време на проучването.

Експериментални диети

Всички експериментални фуражи са формулирани и произведени в SIUC. Тествани са две експериментални диети: диета, базирана на соево брашно и соев протеинов концентрат като основни протеинови източници, заместващи 80% от морските животински протеини (РР диета; соевият концентрат е включен за коригиране на хранителния суров протеин, като същевременно се оставя място за други съставки във формулировката, включително минимално ниво на нишесте, за да се позволи разширяване и плаваемост на експерименталните диети); и диета, основана на рибено брашно като основен протеинов източник (FM диета). И двете диети са формулирани като изонитрогенни (49% суров протеин) и изолипидни (10% липиди) (Таблица 1).

Всички сухи протеинови съставки (рибно брашно, брашно от крил и соево брашно) се добавят към центробежна мелница (Retsch Haan, Германия) и се смилат до 0,5 микрометра. След процеса на смилане, всички съставки се пресяват ръчно през сито от 0,25 микрометра, за да се гарантира, че всички частици са с подходящ и еднакъв размер. Всички сухи съставки (с изключение на соевия лецитин и холин хлорид) се добавят заедно и се разбъркват в продължение на 15 минути и след това рибеното масло се добавя към соевия лецитин, разтворен в маслото. Маслото и сухите съставки се смесват отново в продължение на 15 минути. Накрая вода (

10–15% от общата маса на фуража) се добавя с разтворен холин хлорид. След това фуражите се добавят бавно към екструдера (Caleva Extruder 20, Sturminster Newton Dorset, England) на нива между 20–24 rpm, за да се получи подходящ размер и твърдост на екструдата. След това екструдатите бяха обработени с помощта на сферонизатор (Caleva, Sturminster Newton Dorset, Англия) при 600 об/мин за 3 минути, 1800 об/мин за 30 секунди и след това 600 об/мин за 2-5 минути, за да завърши процеса. Накрая екструдатите бяха изсушени с помощта на сушилня за замразяване (Labconco, Kansas City, MO). Всички изсушени пелети се пресяват до подходящи размери, като се използва вибрационно сито за разбиване (Retsch Hann, Германия). Всички готови фуражи се съхраняват в торби при -20 ° C. Докато фуражите се използват за експерименти, те се държат при 4 ° C.

Експериментален дизайн

При 3 dph ларвите на зебрата бяха разпределени произволно в 12 (3 L) резервоара, по 100 ларви на резервоар. Изследването продължи, докато рибата достигне 66 dph. Изследвани са четири различни режима на хранене: 1) Първата група е получавала FM-базирана диета след периода на живата храна от 13–36 dph и е била предизвикана с PP-базирана диета между 36–66 dph (контрол, NP-FM); 2) Втората група получи NP с диетичен PP в ранния стадий на ларви чрез обогатяване на жива храна по време на 3–13 dph, последвана от диета на базата на рибено брашно (FM) по време на 13–36 dph и диета на базата на PP през 36–66 dph (NP -PP); 3) Третата група получи NP с диетичен PP между 13–23 dph чрез формулирана диета след периода на живата храна, последван от FM-базирана диета по време на 23–36 dph и PP-базирана диета по време на 36–66 dph (T-NP); и 4) Четвъртата група е получавала PP-базирана диета след периода на живата храна от 13–66 dph (отрицателна контрола; PP) (Фигура 1).

NP - хранително програмиране, FM - рибно брашно, PP - растителен протеин, SBM - соево брашно.

За NP на групата NP-PP се приготвя обогатяване на живата храна със соево брашно. Както ротификаторите, така и Artemia nauplii бяха обогатени чрез добавяне на предварително пресято ситно смляно соево брашно (Фигура 2. Колотърсачите след 2 часа обогатяване със спирулина или смляно, смесено и пресято соево брашно.

Измерени отговори

В края на изпитанието за хранене, рибите във всеки резервоар бяха преброени и претеглени. Оценени са следните количествено определени параметри на ефективността на растежа:

  • Оцеляване (%) = 100 × (краен брой риби/първоначален брой риби)
  • Крайно тегло (g) = Крайно телесно тегло - първоначално телесно тегло
  • Повишаване на теглото (% от първоначалното тегло) = 100 × (крайно телесно тегло – първоначално телесно тегло)/първоначално телесно тегло.

В началото (NP фаза), в средата (контролна фаза) и в края на опита (PP предизвикателство) приемът на фураж се оценява чрез измерване на количеството фураж, консумиран за едно хранене във всеки резервоар (храненето е прекратено когато рибите показват признаци на отхвърляне на фураж).

В края на проучването се вземат проби от риби 3 часа (нива след хранене) и 24 часа (физиологични изходни стойности) след хранене от всяка група и се съхраняват в RNALater ® (Sigma-Aldrich, St Louis, MO), за да се оцени експресията на храносмилателни хормони. Освен това бяха взети проби от три риби от всеки резервоар, храносмилателните им пътища бяха дисектирани и консервирани в 10% буфериран формалин за хистологична оценка на чревните власинки.

Анализ на храносмилателния хормон

Анализът на генната експресия на храносмилателните хормони е проведен в лабораторията по биотехнологии на животните и аквакултури към Департамента по биотехнологии и науки за живота в Университета на Инсубрия, Варезе, Италия.

Общо извличане на РНК и синтез на кДНК.

Общата РНК беше извлечена от проби от мозък и черва на данио, използвайки автоматична система (Maxwell® 16 Instrument, Promega). Екстрахираната РНК се определя количествено с помощта на спектрофотометър NanoDrop ™ 2000c (Thermo Scientific) и се транскрибира обратно в cDNA, следвайки протокола, описан в SuperScript III комплект за обратна транскриптаза (Invitrogen, Милано, Италия).

Дизайн и амплификация на праймера и молекулно клониране и секвениране на пет целеви гена.

Праймерите за амплифициране на гени на грелин, лептин, холецистокинин (CCK), орексин и невропептид Y (NPY) са проектирани въз основа на cDNA последователностите на тези гени в Danio rerio, налични в базата данни на GenBank. Номерата за присъединяване на последователностите са AM055940.1 за грелин, BN000830.1 за лептин, XM_001346104.6 за CCK, NM_001077392 за орексин и BC162071.1 за NPY ген. Последователностите на грунда са изброени в Таблица 2.

Аликвотна част от cDNA, получена чрез обратна транскрипция, се амплифицира чрез PCR, използвайки проектираните набори праймери. Най-накрая плазмидът се пречиства с помощта на NucleoSpin® Plasmid kit (Macherey-Nagel, Милано, Италия) и след това се секвенира в двете посоки (T7 и SP6).

Количествена RT-PCR в реално време

Генериране на in vitro транскрибирани иРНК за целеви гени.

Въз основа на cDNA последователностите на зебриновите грелин, лептин, CCK, орексин и NPY гени, секвенирани, както е споменато по-горе, са проектирани праймери и реверсивни праймери за всеки ген (Таблица 3). Предните праймери са проектирани да съдържат в 5 ’края последователността на промотора на ТЗ РНК полимераза, която е необходима за in vitro транскрипция на иРНК на всеки целеви ген. Праймерите T3 напред и съответните им обратни праймери се използват в конвенционална PCR реакция, започвайки от плазмид. След това PCR продуктът се проверява на агарозен гел, пречиства се и впоследствие се секвенира.

Секвенирането беше необходимо както за потвърждаване на присъствието на Т7 промотора, така и за преброяване на броя на наличните нуклеотиди за последващо изчисляване на молекулното тегло (MW - молекулно тегло) на всеки стандарт, определено по следната формула: MW = [(n ° от основи A x 329,2) + (n ° от основи U x 306,2) + (n ° от основи C x 305,2) + (n ° от основи G x 345,2)] + 159.

In vitro транскрипция се извършва с използване на T3 RNA полимераза и други реагенти, доставени в комплекта RiboProbe In vitro Transcription System (Promega, Италия), съгласно протокола на производителя. Концентрацията на така получените иРНК се измерва чрез отчитане на абсорбцията при 260 nm с помощта на NanoDrop ™ 2000c (Thermo Scientific). Чрез познаване на молекулното тегло и концентрацията на всяка иРНК беше възможно да се определи броят на молекулите/μL за всеки целеви ген.

Генериране на стандартни криви и RT-PCR в реално време за количествено определяне.

Синтетичните иРНК на всеки ген бяха използвани като количествени стандарти при анализа на биологични проби. За това сто нанограма от общата РНК, извлечена от рибни проби, бяха амплифицирани чрез едноетапна количествена RT-PCR в реално време SYBR ® Green, в същата плака с определени количества синтетични иРНК при 10-кратно разреждане, използвайки iTaq ™ Universal Комплект SYBR ® Green One-Step (Bio-Rad, Италия). Последователностите на праймерите, използвани за амплификация на целеви ген, са показани в Таблица 4. SYBR ® Зелени PCR реакции са проведени върху система Bio-Rad ® CFX96 ™.

Данните от PCR в реално време са събрани със софтуера CFX ™. Стойностите на Ct на стандартното усилване на иРНК бяха използвани за създаване на стандартни криви, които след това бяха използвани за изчисляване на копията на иРНК в биологичните проби.

Хистологични анализи

Червата, фиксирани преди това в 10% неутрален буфериран формалин, се обработват до парафин, като се използва автоматизиран тъканен процесор, затворен от Sakura (Холандия). Трите представителни области на червата на данио са ориентирани за напречни сечения, вградени заедно в един и същ блок. Пет последователни участъка от микрометър бяха изрязани с ръчен микротом на Leica (Buffalo Grove, IL) и поставени на водна баня при 44 ° C. Секциите бяха поставени върху слайдове с положително зареждане. След изсъхване предметните стъкла се оцветяват с хематоксилин и еозин и се плъзгат с капак с помощта на акрилни монтажни среди. Хистологичният анализ на средните чревни части на храносмилателния тракт на рибите се фокусира върху тъканните участъци със среден диаметър. Снимките на пробите са направени със 100-кратно увеличение с помощта на микроскоп (Nikon SMZ1500, Япония) и камера (Nikon Digital Sight, Япония).

За да се получат дължина и ширина на вилусите, бяха получени снимки на всеки слайд с помощта на комбинация от микроскоп (Leica DMI 300B) и камера (Leica DMC 290), със софтуера LAS V4.4 (Leica Camera, Wetzler, Германия). От тези снимки бяха направени индивидуални дължини и ширини на непокътнати вили с помощта на ImageJ (NIH, Betheseda, MD, USA). Данните за дължина и ширина са измерени според Karimi и Zhandi [17] в трите различни сегмента на червата; проксимално, средно и дистално. Дължината на вилите е измерена от върха на вилуса до луминалната повърхност, а ширината на вилите е измерена през основата на вилуса на луминалната повърхност. Съотношението дължина/ширина на всяка вилус се определя чрез разделяне на дължината на ширината.

статистически анализи

Резултатите са представени като средни стойности ± стандартно отклонение. Използва се еднопосочна ANOVA, последвана от тест на Tukey с помощта на софтуера R. Различия със стойности p Таблица 5. Ефект от диетичното лечение върху ефективността на растежа.

Стойностите са представени като средни стойности (± std. Dev). Горните букви показват статистическа значимост между групите. Значимостта е определена с помощта на еднопосочен ANOVA и тест на Tukey със стойност p Фигура 3. Експресия на грелин в мозъка и червата.

Експресията на грелин, представена като брой копия на транскрипт на грелин на ng от общата РНК в мозъка и червата на зебра в 3 часа (В) и 24 часа (А) след хранене. Промяната в гънката представя разликата в копията на грелински преписи между 3 и 24-часови проби. Различните букви показват статистическа разлика при p Фиг. 4. Експресия на CCK в мозъка и червата.

Експресията на CCK, представена като брой копия на CCK транскрипт на ng от общата РНК в мозъка и червата на данио 3 часа (B) и 24 часа (A) след хранене. Промяната на сгъването представя разликата в копията на CCK преписи между 3 и 24-часови проби. Различните букви показват статистическа разлика при p Фигура 5. Експресия на лептин в мозъка и червата.

Експресията на лептин, представена като брой копия на лептинов транскрипт на ng от общата РНК в мозъка и червата на данио 3 часа (B) и 24 часа (A) след хранене. Промяната в гънката представя разликата в копията на лептинов транскрипт между 3 и 24-часови проби. Различните букви показват статистическа разлика при p 0,05). Подобна тенденция се наблюдава и в червата, но всъщност не се откриват значителни разлики (Фигура 6).

Експресията на орексин, представена като брой копия на транскрипт на орексин на ng от общата РНК в мозъка и червата на даниото на 3 часа (В) и 24 часа (А) след хранене. Промяната на гънките представя разликата в копията на транскрипт на орексин между 3 и 24-часови проби. Различните букви показват статистическа разлика при p Фиг. 7. Експресия на NPY в мозъка.

Експресията на NPY, представена като брой копия на NPY транскрипт на ng РНК в мозъка на данио 3 часа (B) и 24 часа (A) след хранене. Промяната на сгъването представя разликата в копията на NPY преписи между 3 и 24-часови проби. Различните букви обозначават статистическа разлика при p Таблица 6. Ефект на лечение върху дължината, ширината и съотношението на дължината към ширината на червата.