Резюме

Заден план

Целта на това проучване беше да се изследват ефектите от субхронична диета с високо съдържание на мазнини и захароза (наричана още „западна диета“ или WD), хранеща се с чернодробния транскриптом по време на ранното развитие на безалкохолна мастна чернодробна болест (NAFLD).

Методи

Кафявите норвежки мъжки плъхове (на 9-месечна възраст) бяха разпределени на случаен принцип, за да получат ad libitum достъп до контрола (CTL; ​​14% kcal мазнини, 1,2% тегловни захароза) диета или WD (42% kcal от мазнини, 34% захароза тегловно ) в продължение на 6 седмици.

Резултати

Шест седмици WD хранене причиняват развитие на чернодробна стеатоза, както се доказва от 2,25-кратно увеличение на съдържанието на триацилглицерол в черния дроб, но не предизвиква напреднало чернодробно заболяване (т.е. без явно възпаление или фиброза) при възрастни плъхове от Кафява Норвегия. Дълбокото секвениране на РНК (RNA-seq) разкрива, че 94 транскрипта са били променени в черния дроб чрез WD хранене (46 нагоре, 48 регулирани надолу, FDR

Заден план

Много модернизирани култури консумират богата на калории диета с високо съдържание на мазнини и високо съдържание на захар, наречена западна диета (WD), която допринася за заболявания, свързани със затлъстяването. Едновременно с потресаващото нарастване на епидемията от затлъстяване е разпространението на неалкохолната мастна чернодробна болест (NAFLD), което сега се оценява да повлияе

30% от възрастното население в Съединените щати и присъства при 75-100% от затлъстелите или болестно затлъстели индивиди [1, 2]. NAFLD е прогресиращо чернодробно заболяване, вариращо от проста стеатоза, неалкохолен стеатохепатит (NASH), фиброза и цироза [3]. Характеризира се с повишено съхранение на чернодробни триглицериди (TG) (≥5 тегловни%) при липса на прекомерна консумация на алкохол (

Методи

Парадигма за хранене на животни и диети

Всички експериментални протоколи бяха одобрени от Комитета по грижа и употреба на животните в Университета на Мисури. Деветмесечни мъжки плъхове от Браун Норвегия (Charles River Laboratory, O ’Fallon, Missouri) бяха разпределени в една от следните две групи за 6 седмици: 1) ad libitum WD хранене (WD; н = 8); и 2) ad libitum диета с ниско съдържание на мазнини/ниско съдържание на захар (CTL; н = 6). WD (TD.88137; Harlan Laboratories) съдържа следния хранителен състав: 4,5 kcal/g, 15,2% протеин (изразено като% kcal), 42,7% въглехидрати (изразено като% kcal), 42,0% мазнини (изразено като% kcal ) и 0,2% холестерол (тегловни). Трябва да се отбележи, че тази диета е била използвана в предишни проучвания на гризачи за извличане на NASH [11, 12]. CTL (LabDiet® Certified CR 14% протеинова диета за гризачи) съдържа следния хранителен състав: 3,5 kcal/g, 16,1% протеин (изразено като% kcal), 69,3% въглехидрати (изразено като% kcal), 14,6% мазнини (изразено като% kcal) и 0,014% холестерол (тегловни). WD също съдържа висок процент захароза (34% от общата диета по тегло), докато CTL не (1,2% от общата диета по тегло).

Плъховете бяха настанени поотделно в стандартни клетки за плъхове в контролирани от температура квартири за животни (21 ° C) със светлинен цикъл 0700–1900: 1900–0700, който се поддържаше през целия експериментален период. Приемът на храна се измерва внимателно ежеседмично (т.е. наблюдение на дъното на клетките за хапки и т.н.), а общият прием на калории по време на проучването е докладван другаде [10].

Процедури за евтаназия

Процедурите за евтаназия са описани подробно другаде [10]. Накратко, в деня на евтаназията, клетките за животни бяха отстранени от помещенията за животни между 0800–0900 и храната беше отстранена от всяка клетка. Евтаназията се проведе между 1400–1900 г. и плъховете бяха жертвани под CO2 газ в домашните им клетки, за да се сведе до минимум стресът. Впоследствие цялата кръв се отстранява чрез сърдечни пръчици с помощта на игла и спринцовка с 21 габарит, поставя се в серумна сепараторна тръба, центрофугира се при 3200 об/мин в продължение на 5 минути, серумът се аликвотира в 1,7 мл епруветки за микроцентрифугиране и серумът се замразява за по-късно оценка на серумния цитокин. Отделни средни дялове на черния дроб (

50–100 mg) впоследствие бяха отстранени с помощта на стандартни техники за дисекция и бяха бързо замразени в течен азот за процедури за дълбоко секвениране на РНК, анализ на фосфопротеини по NF-кВ път и анализ на чернодробно трихромно и триацилглицеролово (TAG) анализ.

Чернодробно трихромно оцветяване и съдържание на TAG

Съдържанието на хистохимично интрахепатално TAG се определя, както е описано по-рано [13]. За да се изследва морфологията на черния дроб, фиксирани с формалин, вградени в парафин черни дробове бяха разделени и оцветени с трихромно петно ​​за отлагане на колаген/фиброза.

Чернодробни РНК-последователни методи

Изолация на РНК и подготовка на cDNA

Два микрограма чернодробна РНК от WD (н = 6) и CTL (н = 6) плъхове са изпратени в ДНК-ядрото на Университета на Мисури за RNA-seq процедури. Трябва да се отбележи, че само 6 от 8 плъхове с WD са били използвани за RNA-seq поради ограничени ресурси. Високата РНК цялост на всяка проба беше потвърдена с помощта на автоматизирана система за електрофореза BioAnalyzer 2100 (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) преди изграждането на cDNA библиотека. Подготовката на cDNA библиотека впоследствие беше извършена, използвайки протокола на производителя с реагенти, доставени в комплекта за подготовка на проби на РНК TruSeq на Illumina v2. MRNA, съдържаща поли-А, се пречиства от 2 μg обща РНК, РНК се фрагментира, двуверижна кДНК се генерира от фрагментирана РНК и индексите, съдържащи адаптери за идентификация на пробата, се лигират до краищата. Окончателната конструкция на всяка пречистена библиотека беше оценена с помощта на автоматизирана система за електрофореза BioAnalyzer 2100, количествено определена с флуорометър Qubit с помощта на реактивния комплект QUANT-iT HS dsDNA (Invitrogen, Life Technologies, Grand Island, NY) и разредена съгласно стандартното секвениране на Illumina протокол за секвениране на HiSeq 2000.

Последователност на илюмина на NAc cDNA и статистически анализи на RNA-seq данни

Процедурите за RNA-seq са настъпили в ДНК на Университета на Мисури и са описани по-подробно другаде [14]. Накратко, след изграждането на библиотека на cDNA, пробите бяха заредени в поточна клетка, където бяха копирани клъстерите на всеки олиго. Следвайки тази процедура, поточните клетки бяха поставени в секвенсора и флуоресцентно-маркирани основи бяха прикрепени към комплементарните основи на всяка последователност. Геномният анализатор Illumina записа 50 bp четения. Четенията бяха изрязани, за да се осигури премахване на последователността на адаптера, и с помощта на NextGENe v1.92 (SoftGenetics, State College, PA).

Чернодробно определяне на NF-кВ фосфопротеиновия път

Определяне на серумен цитокинен профил

Серумните проби бяха анализирани в два екземпляра за концентрации на лептин, IL-1β, IL-6, MCP-1 и TNF-α, като се използва мултиплексен анализ на цитокини (Millipore Milliplex, cat no. RCYTOMAG-80 K; Billerica, MA, USA) на инструмент MAGPIX (Luminex Technologies; Luminex, Austin, TX, USA) в съответствие с инструкциите на производителя.

Статистика и биоинформатика за данни за чернодробна РНК-последователност

Диференциалните модели на генна експресия бяха анализирани за коментирани гени между групите WD и CTL, като се използва четене на килобаза на милион картографирани четения (RPKM). Счита се, че диференциално експресираните чернодробни mRNAs са значими, когато р-стойностите на WD/CTL пъти промяна на фалшивото откриване (FDR) са

Резултати

Фенотипични промени след 6 седмици WD спрямо CTL хранене

Фенотипни промени в WD спрямо CTL плъхове са представени в Таблица 1 по-долу. Както се съобщава по-рано [10], храненето с WD значително увеличава телесната маса при жертва с 6% (стр = 0,0019), маса на мастната тъкан с 52% (стр Таблица 1 Характеристики на животните след 6 седмици WD спрямо CTL хранене

Храненето с WD нарушава чернодробната експресия на гени, свързани със синтеза на холестерол и мастни киселини

Използване на статистическа граница на FDR Фиг. 1

диета

От транскриптите, отговарящи на статистическата граница на FDR 2.0-кратно между WD спрямо CTL плъхове, докато 17 mRNAs са регулирани надолу> -2.0 пъти (Таблица 2); повечето от тях са свързани с биосинтеза на холестерол (WD/CTL тРНК промяна в пъти: Cyp51a1 -8,43, Tm7sf2 -8,39, Hmgcs1 −6,82, Msmo1 -6,48, Insig1 −4,71, Fdps -3.74, Pcsk9 -3,56, Lss -2.39, Pmvk -2.28), синтез на мастни киселини (WD/CTL тРНК промяна в пъти: Scd +28.4, Fads1 −3,74, Акли -2.88, Acss2 -2,43) и лекарствения метаболизъм (WD/CTL тРНК промяна в пъти: Cyp2c18 + 2.50, Cyp51a1 -8,43, Ugt2a3 -2,13).

Храненето с WD не засяга системните или чернодробните провъзпалителни маркери, но умерено влияе на маркерите на острата фаза на протеиновия отговор

Изненадващо, шест седмици хранене с WD не повлияват значително серумните цитокини (фиг. 3а-д) и/или чернодробните фосфо-IkBα и/или фосфо-NF-кВ р65 моделите (фиг. 3f/g). По същия начин, отчитанията на RNA-seq за гени, свързани с TNF-α сигнализиране, IL-6 сигнализиране и IL-1β сигнализиране, предполагат, че 6 седмици WD хранене предизвиква само умерени промени в гените за сигнализация на възпалителния път на цитокините (Таблица 3). По-конкретно, IL-1β иРНК и Jak3 иРНК (IL-6 надолу по веригата ефектор) бяха регулирани нагоре в WD спрямо CTL плъхове (номинална р-стойност Фиг. 3

Ефекти от храненето с WD върху системни и чернодробни провъзпалителни маркери. Серумни концентрации на лептин (а), IL-1β (б), IL-6 (° С), MCP-1 (д) и TNF-α (д). Съдържание на чернодробни протеини за фосфо-IkBα и фосфо-p65 (е & ж). Стойностите са средни стойности ± SE. Храненето с WD обикновено повишава серумния лептин в сравнение с CTL плъховете (стр = 0,07), като същевременно не засяга други провъзпалителни серумни маркери. Освен това, храненето с WD не повлиява чернодробните маркери на NF-κB сигнализиране

Дискусия

Тези усилия за извличане на данни с RNA-seq осигуряват уникална снимка на чернодробните транскриптомни промени, които се случват при субхронично WD хранене при възрастни плъхове от Браун Норвегия. Въпреки че демонстрира, че по-дългите графици на хранене с високо съдържание на мазнини и захар причиняват увеличаване на възпалението на черния дроб [17], оксидативен стрес [18], фиброза [17, 18] и митохондриална дисфункция [19, 20], тук предоставяме доказателства, че субхроничното хранене с WD причинява бърза дисрегулация в определени гени на метаболизма на чернодробните липиди и холестерола при плъхове; ефект, който: а) може да допринесе за удвояване на съдържанието на TG в черния дроб, представено тук; и б) може да е отговорен за нивата на серумния холестерол, които са склонни да се увеличават след 6 седмици хранене с WD, както беше съобщено по-рано [10]. Освен това, RNA-seq анализите разкриват, че докато голяма част от провъзпалителните медиатори остават непроменени при западно диетично хранене, избрани чернодробни транскрипти, свързани с сигнализиране за възпаление в остра фаза, са променени с субхронично WD хранене в условията на чернодробна стеатоза.

Шест седмици хранене с WD засягат предимно моделите на експресия на чернодробната иРНК, свързани с липидния метаболизъм и биосинтезата на холестерола

Основната констатация от настоящото проучване е, че субхроничното хранене с WD причинява бързи промени в избраните гени за метаболизъм на липиди и холестерол, което от своя страна вероятно допринася за наблюдаваните увеличения в натрупването на мазнини в черния дроб и нарушаване на регулацията на нивата на серумния холестерол.

Поразителното 28,3-кратно увеличение на черния дроб Scd1 иРНК с 6 седмици WD хранене подчертава потенциалното значение на този ген в развитието на NAFLD. Ензимът Scd1 катализира синтеза на мононенаситени дълговерижни мастни киселини от наситени мастни ацил-CoAs [21], а мишките с дефицит на Scd1 имат по-малко натрупване на чернодробни мазнини [22–24]. Наистина, фармакологично [25] и генетично [26] нокаутира Scd1 е доказано, че благоприятно променя състава на мастните киселини в чернодробната тъкан на мишки. По този начин нашите данни са в съгласие с гореспоменатата литература, предполагаща, че индуцирана от храната свръхекспресия на черния дроб Scd1 може да е от решаващо значение за ранното развитие на NAFLD. Чернодробен цитохром P450 полипептид 18 (Cyp2c18) също се регулира 2,7 пъти в WD спрямо CTL плъхове. В адипоцитите, Cyp2c18 се смята, че работи в съгласие с Scd1 за окисляване на мастните киселини, след като те са ненаситени [27]. Cyp2c18 също се смята, че участва в метаболизма на чернодробната арахидонова киселина и линолевата киселина [28] и е доказано, че е регулиран в други модели на NAFLD [29].

Шест седмици WD хранене засягат избрани чернодробни протеини с остра фаза и свързани с фиброза модели на експресия на иРНК, но не локални или системни провъзпалителни биомаркери

Различни маркери на чернодробно възпаление обикновено не са били повишени при 6 седмици WD хранене при възрастни плъхове от кафява Норвегия, въпреки значителното развитие на чернодробна стеатоза. Тези резултати разширяват данните на мишката върху плъхове. Stanton et al. [16] по-рано демонстрираха, че мишките C57BL/6, хранени с диета с високо съдържание на мазнини/висок холестерол в продължение на 6 седмици, не показват увеличение на няколко провъзпалителни чернодробни хемокинови мРНК, но вместо това показват значително увеличение на тези маркери 16 и 26 седмици след хранене. Независимо от това, ние демонстрирахме, че експресията на мРНК на многобройни протеини с остра фаза е променена (някои се увеличават, докато други намаляват) след 6 седмици WD хранене при възрастни плъхове. Протеините с остра фаза са протеини, произвеждани от черния дроб, за които се смята, че увеличават или намаляват в плазмата с 25% в отговор на имунологичен или възпалителен стимул [37]. Наличието на остра фазова реакция към NAFLD и NASH се разпростира и върху данните на мишките [38, 39]. Радонич и др. [40] демонстрира, че чернодробните иРНК за няколко реагенти с остра фаза в рамките на дни след диета с високо съдържание на мазнини при ApoE3L мишки. Следователно, настоящите ни данни показват, че гените на чернодробна остра фаза могат да бъдат индуцирани рано по време на WFLD, индуциран от WD; находка, която може да отграничи ранен провъзпалителен стимул.

Интересното е, че двукратното повишено от WD увеличение на чернодробния тромбоцитен фактор 4 (Pf4 или Cxcl4) тРНК може да бъде ранен индикатор или дори инициатор на фиброза, който следва развитието на NAFLD. Доколкото ни е известно, други проучвания, използващи модели на NAFLD, не показват, че този ген се променя, въпреки че е доказано, че Pf4 индуцира фиброза [41]. Наистина, Pf4 Доказано е, че иРНК се регулира нагоре при пациенти с алкохолен хепатит [42]. Рекомбинантен миши Cxcl4 също така е доказано, че стимулира пролиферацията, хемотаксиса и експресията на хемокини на чернодробни звездни клетки [41]; явление, което предполага, че може да има потенциална роля за неговата индукция в развитието на неалкохолен стеатохепатит.

От серумните провъзпалителни цитокини, измерени в настоящото проучване, само серумният лептин има тенденция да бъде 2,4 пъти по-висок при WD спрямо плъхове CTL. В действителност е показано, че по-дългите режими на хранене с високо съдържание на мазнини и/или с високо съдържание на захар увеличават серумните нива на избрани провъзпалителни цитокини. Докато лептинът се разглежда главно като адипокин, участващ в регулирането на апетита, някои доказателства подкрепят неговата роля за стимулиране на възпалителна реакция [44, 45]. Например, липса на лептин ob/ob мишки с нарушение на функцията на макрофагите [46]. Други проучвания също показват, че лептинът е необходим за развитието на чернодробна фиброза при липса на лептин ob/ob модел на мишки [47, 48]. По този начин, нашите данни подкрепят хипотезата, че индуцираното от WD повишаване на нивата на лептин може да предшества и дори да е разрешително за възникване на последваща чернодробна фиброза с по-дългосрочно предизвикателство за WD.

И накрая, липсата на повишена NF-κB сигнализация при плъхове, хранени с WD, може да се дължи на краткосрочния график на хранене, използван в настоящото проучване. Всъщност генетично изменени миши модели (Ldlr -/- и Апое2-е доказано, че представят силно чернодробно възпаление (чрез NF-κB сигнализация) и стеатоза в рамките на 21 дни след хранене с високо съдържание на мазнини/висок холестерол, въпреки че мишки от див тип в същото проучване развиват само извънматочно отлагане на мазнини без явно възпаление [ 49]. Независимо от това, 6-седмичното хранене с WD в настоящото проучване причинява чернодробна стеатоза, но изглежда недостатъчно по продължителност, за да се развие хистологичен NASH с възпаление и фиброза.