Влезте с вашето потребителско име и парола

Главно меню

Влезте с вашето потребителско име и парола

Ти си тук

  • У дома
  • Архив
  • Том 52, брой 6
  • Инфекцията с Helicobacter pylori предизвиква дуоденит и повърхностна язва на дванадесетопръстника при монголски гербили
  • Член
    Текст
  • Член
    информация
  • Цитат
    Инструменти
  • Дял
  • Отговори
  • Член
    метрика
  • Сигнали
  1. Т Окуса 1,
  2. I Okayasu 2,
  3. H Miwa 1,
  4. К Отака 1,
  5. S Endo 3,
  6. N Сато 1
  1. 1 Катедра по гастроентерология, Медицински факултет на университета Juntendo, Токио, Япония
  2. 2 Катедра по патология, Медицински факултет на Университета Китасато, Сагамихара, Япония
  3. 3 Център за изследвания на животни, Токийски медицински и дентален университет, Токио, Япония
  1. Кореспонденция на:
    Д-р N Sato, Катедра по гастроентерология, Медицинско училище в Университета Juntendo, 2-1-1 Hongo, Bunkyo-ku, Токио 113-8421, Япония;
    nsatomed.juntendo.ac.jp

Резюме

Заден план: Няма преки доказателства за животински модел на язва на дванадесетопръстника, индуцирана от Helicobacter pylori.

дуоденит

Цел: В това проучване оценихме ролята на бактериалния щам и възрастта на опитни животни при индуцирането на дуоденит и язва на дванадесетопръстника при монголски гербили след инфекция с H pylori.

Методи: Монголски гербили без специфични патогени бяха инокулирани орално с три бактериални щама (H pylori ATCC 43504, TN2GF4 и K-6, клиничен изолат от пациент с рак на стомаха в нашата клиника). Тези щамове имат както cagA гена, така и VacA. Използвани са петседмични гербили за емулиране на недоносена инфекция, а 14-седмични животни са използвани като зрели тестови субекти. Животните са наблюдавани в продължение на 12 седмици след инокулацията. Производството на интерлевкин 8 (IL-8) в стомашните епителни клетки (MKN74) след съвместно култивиране с щамовете H pylori е измерено чрез ELISA.

Резултати: Гастрит и стомашни язви са открити при всички гербили, заразени с трите щама. Дуоденит и стомашна метаплазия обаче се наблюдават по-често при гербили, заразени с щамове TN2GF4 и K-6, отколкото при заразени ATCC 43504 или контролни групи (p

Статистика от Altmetric.com

  • язва на дванадесетопръстника
  • Монголски гербили
  • Helicobacter pylori
  • дуоденит
  • язва на дванадесетопръстника
  • VacA, вакулиращ цитотоксин А
  • CFU, единици, образуващи колонии
  • PAS, периодична киселина-Шиф
  • ELISA, ензимно свързан имуносорбентен анализ
  • OD, оптична плътност
  • IL-8, интерлевкин 8
  • FBS, фетален говежди серум

Инфекцията с хеликобактер пилори причинява язва на дванадесетопръстника, повечето стомашни язви 1 и аденокарцином 2 при хората. Описани са експериментални модели на инфекция с H pylori, използващи гнотобиотични прасенца, 3 мишки без евтимични зародиши, 4 голи мишки с атимични, 5 и маймуни. 6 Монголският гербил също изглежда подходящ животински модел на инфекция с H pylori. 7-9 Стомашно-чревни заболявания като гастрит, стомашна язва и аденокарцином, имитиращи човешка инфекция с H pylori, могат да бъдат изследвани в модела на монголски гербили. Няма обаче преки доказателства, че инфекцията с H pylori всъщност индуцира язви на дванадесетопръстника в този модел на животни. Ефектите на променливи като разликите в щамовете при инфекция с H pylori и възрастта на експерименталното животно не са изследвани.

В това проучване заразихме както незрели, така и зрели монголски гербили с три щама H pylori. Нашата цел беше да проучим ролята както на бактериалния щам, така и на възрастта на пациента върху еволюцията на язви на дванадесетопръстника след инфекция с H pylori.

МЕТОДИ

Бактериални щамове

Бактериалните щамове, използвани в това проучване, са H pylori ATCC 43504 (American Type Culture Collection, Manassas, Virginia, USA), TN2GF4 (подарък от Takeda Chemical Industries, Ltd, Осака, Япония) и K-6, който е изолиран от пациент с рак на стомаха в нашата клиника. Тези щамове имат както cagA ген, така и вакуолиращ цитотоксин А (VacA), което е потвърдено чрез методите на полимеразна верижна реакция 10 и цитотоксинов анализ. 11 Бактериите се култивират при микроаерофилни условия при 37 ° С в продължение на четири дни върху кръвен агар. Последващата култура е в продължение на 24 часа в бульон Brucella (Difco Laboratories, Детройт, Мичиган, САЩ) с 10% конски серум.

Животни

Специфични мъжки монголски гербили без патогени (отглеждани в Центъра за изследвания на животните, Токийския медицински и дентален университет) са заразени на възраст пет и 14 седмици. Без специфичен патоген означава, че гербилите не са заразени и не съдържат вируса на Сендай, вируса на миши хепатит, Mycoplasma pulmonis, Clostridium piliforme, Dermatophytes, Citrobacter rodentium, Pasteurella pneumotropica, Corynebacterium kutscheri, Pseudomonas aerginosa, Salmonecoc Myplaplasma, Myaplamo muris, Spironucleus muris, Syphacia spp, Helicobacter spp и Aspicularis tetrapttera. Три до пет животни бяха настанени на клетка и им беше предоставен безплатен достъп както до търговска диета за гризачи (CE-2; Clea Japan, Токио, Япония), така и до стерилна вода. На животни, които са гладували в продължение на 24 часа, се дава чрез игла за хранене единична интрагастрална доза от 1 ml от 1 × 10 8 образуващи колонии единици (CFU)/ml суспензия от H pylori. Контролните животни са получавали бульон Brucella само.

Хистопатология и култура

Както експериментално заразените, така и контролните гербили бяха умъртвени чрез дислокация на шийката на матката под анестезия 12 седмици след инокулацията. Стомасите бяха отворени по протежение на по-голямата кривина, започвайки от гастро-езофагеалната връзка и завършвайки в проксималната част на дванадесетопръстника, и всички гастродуоденални лезии бяха наблюдавани макроскопски. Половината от пробата беше телбодирана върху хартия и фиксирана в 10% неутрален буфериран формалин за хистологично изследване чрез рутинни методи. Фиксираната тъкан се нарязва на надлъжни ленти за изследване на гастродуоденалната лигавица. Парафиновите вградени секции бяха изрязани и оцветени с хематоксилин-еозин, Giemsa и периодична киселина-Schiff (PAS).

Останалата половина от образеца се хомогенизира с бульон Brucella, разрежда се и се инокулира върху модифициран агар на Skirrow. Културите се инкубират при 37 ° С в продължение на седем дни при микроаеробни условия. Инфекцията се определя количествено чрез преброяване на колонии на плака и се изразява като log CFU на гастродуоденална стена.

Дебелината на лигавицата от пилорен тип се измерва в пет произволно избрани точки на зоната на фовеоларния епител в средния антрален отвор на оцветени с хематоксилин-еозин предметни стъкла, получени от стомаха на всеки гербили Тъй като възпалителният компонент на лигавицата е практически идентичен с този, открит при човешкия H pylori гастрит, степента на активност, възпалението, атрофията и чревната метаплазия се оценява според актуализираната система в Сидни. 12 Наличието на H pylori е диагностицирано хистологично в проби, оцветени с Giemsa. Проксималният дванадесетопръстник е потвърден чрез идентифициране на пилорния пръстен и жлезата на Brunner’s. Стомашната метаплазия се определя като поява на огнища на стомашни епителни клетки, съдържащи апикален PAS положителен неутрален муцин, заедно с липсата на граница на четката. Всички патологични анализи са извършени по заслепен начин от един патолог (IO).

Серология

Кръвни проби бяха получени от анестезирани животни чрез сърдечна пункция по време на жертвоприношението. Серумните IgG антитела срещу H pylori бяха измерени чрез ензимно свързан имуносорбентен анализ (ELISA; HM-CAP, EPI, Ню Йорк, САЩ). ELISA система, разработена в Seac Yoshitomi Ltd (Fukuoka, Япония), беше използвана за количествено определяне на анти-H pylori IgG на монголски гербили, използвайки конюгирани с пероксидаза антимиши имуноглобулини (Dako Япония, Токио, Япония) като вторично антитяло. Оптичната плътност (OD) 450 беше измерена спектрофотометрично (Emax; Japan Molecular Device Co., Hyogo, Япония). Стойността на границата от 0,1 OD е показателна за серологичните доказателства за инфекция с H pylori (Ikeda, лична комуникация).

Стимулиране на секрецията на интерлевкин 8 (IL-8) в клетъчната линия на стомашния епител

Щамовете H pylori бяха събрани в модифициран агар Skirrow, съдържащ 10% конска кръв в продължение на седем дни при 37 ° C при микроаеробни условия. След събиране на колонии с пластмасова примка за еднократна употреба, те бяха суспендирани при 1 × 10 7 клетки/ml в RPMI 1640 (Sigma Chemical Co., St Louis, Missouri, USA), съдържащи 10% фетален говежди серум (FBS) (Sigma) и използва се незабавно.

MKN74 човешка стомашна епителна клетъчна линия (JCRB0255; Health Science Research Resources Bank, Осака, Япония) се поддържа в RPMI 1640, допълнена с 10% FBS. За количествено определяне на IL-8, MKN74 клетъчни монослоеве в 24 ямкови плаки се култивират със или без H pylori щамове в продължение на пет часа в три екземпляра. След това супернатантите се отстраняват от ямките, центрофугират се при 15 000 g и се съхраняват при -70 ° C, докато се изследва за IL-8 протеин от ELISA (R&D Systems Inc., Минеаполис, Минесота, САЩ), съгласно протокола на производителя. Всички процедури бяха направени в два екземпляра.

статистически анализи

Характеристики на инфекция с Helicobacter pylori с бактериални щамове ATCC-43504, TN2GF4 и K-6 при монголски гербили

Макроскопски и хистопатологични находки

Антралната лигавица на всички заразени гербили е разширена и удебелена с обилна слуз (фиг. 1А). Лезии на стомашна язва са наблюдавани в антралната част (лигавица от пилорен тип) при всички заразени гербили (фиг. 1А). Дуоденалната лигавица на повечето заразени гербили в групите TN2GF4 и K-6 показва удебелени и ерозивни лезии (фиг. 1В). Контролните животни са имали нормална стомашна и дуоденална лигавица (фиг. 1С).

(А) Антралът на заразения гербил, 12 седмици след инокулирането с бактериалния щам Helicobacter pylori TN2GF4, показва разширена и удебелена лигавица с обилна слуз. Лезии на стомашна язва могат да се видят в антрума (лигавица от пилорен тип, стрелка). (Б) Дванадесетопръстникът на инфектиран гербил от групата TN2GF4 показва удебелена лигавица и две повърхностни язви (стрелки). (В) Стомашната и дванадесетопръстната лигавица на неинфектиран гербил в контролната група не показва видими промени.

Хистопатологичните находки от раздели на стомаха са показани в таблици 2 и 3. Неутрофилна активност и хронично възпаление, характеризиращо се с плътна неутрофилна и мононуклеарна клетъчна инфилтрация и образуване на лимфоиден фоликул както в лигавицата, така и в субмукозата, са наблюдавани във фундалната област на гербили, заразени при 14-седмична възраст (p = 0,008 и 0,009) и в пилорната област и в двете възрастови групи (14 седмици: p = 0,016 и 0,011; пет седмици: p = 0,003 и 0,007). В фундалната област на гербили, заразени на пет седмична възраст, активността на неутрофилите и хроничното възпаление са по-леки и се наблюдават по-рядко, отколкото при животни, заразени на 14 седмици. Във фундаменталната област на гербили, заразени със щам TN2GF4 на 14-седмична възраст, активността на неутрофилите и хроничното възпаление са по-високи от тези на щама ATCC на петседмична възраст и най-високи сред заразените гербили. Дебелината на лигавицата в пилорната област на заразените животни и в двете възрастови групи е значително увеличена в сравнение с контролите (p = 0,008, 0,007), а дебелината на заразените гербили с щам TN2GF4 на 14-седмична възраст е по-висока от тази на щам К-6 на пет седмична възраст и най-висок сред заразените гербили.

Хистологични лезии в стомаха и дванадесетопръстника на монголски гербили, заразени с щамове Helicobacter pylori ATCC-43504, TN2GF4 и K-6

Хистологични резултати в стомаха и дванадесетопръстника на монголски гербили, заразени с щамове Helicobacter pylori ATCC-43504, TN2GF4 и K-6

Язви на стомаха, ограничени до лигавицата (повърхностна язва) или простиращи се до мускулния слой, са наблюдавани в областта на лигавицата от пилорен тип на всички заразени гербили, но не и в лигавицата на фундалния тип (таблица 2). При 17 от 26 заразени животни (65%) стомашните язви в лигавицата от пилорен тип са открити като повърхностни язви (ерозии). При заразени гербили не се наблюдава жлезиста атрофия, чревна метаплазия, хиперпластичен полип или аденокарцином.

(А) Дуоденит, характеризиращ се с плътна неутрофилна и мононуклеарна клетъчна инфилтрация, се наблюдава при гербил, заразен с бактериален щам Helicobacter pylori K-6 (хематоксилин-еозин, първоначално увеличение × 100). (Б) Лигавицата на дванадесетопръстника в гербил, инфектиран с бактериален щам H pylori TN2GF4 на 14 седмици, беше положителна за периодично оцветяване с киселина-Шиф, което показва стомашна метаплазия (първоначално увеличение × 200). (В) Слузта от стомашна метаплазия в дванадесетопръстника в инфектиран гербил от групата TN2GF4, инокулиран на 14 седмици, беше колонизирана с H pylori (стрелки) (Giemsa, оригинално увеличение × 400). (D) Повърхностна язва на дванадесетопръстника (стрелки) в стомашната метаплазия с тежък дуоденит е очевидна при гербил от групата TN2GF4, инокулиран на 14 седмици. Жлезите на Brunner могат да се видят под стомашната метаплазия (хематоксилин-еозин, първоначално увеличение × 100). (E) Не се наблюдава дуоденит при неинфектиран гербил от контролната група (хематоксилин-еозин, първоначално увеличение × 200).

Стимулиране на секрецията на IL-8 в клетъчната линия на стомашния епител

Сравнявайки производството на IL-8 в клетки MKN74 след култивиране с щамове H pylori, щам TN2GF4 стимулира значително по-високи нива на IL-8 (1538 (303) pg/ml) (фиг. 3), отколкото щам ATCC 43504 (154 (24) pg/ml; p = 0,0039) и K6 (175 (6) pg/ml; p = 0,0039). Производството на IL-8 от щамове ATCC 43504 и K6 е значително по-високо от контролите (55 (8) pg/ml; p = 0,0038 и 0,0039, съответно).

Производство на интерлевкин 8 (IL-8) в клетки MKN74 след кокултура с трите бактериални щама на Helicobacter pylori. ** p 7–9, 13–17, но появата на язва на дванадесетопръстника не е постоянна характеристика на инфекцията. Леко до умерено възпаление в дванадесетопръстника е съобщено 12 и 24 седмици след инфекция с щам ATCC 43504, но не са открити улцеративни лезии и не е описана появата на стомашна метаплазия. 13, 14 В това проучване сме докладвали за появата на язва на дванадесетопръстника при монголски гербили, заразени с H pylori на 14-седмична възраст. Язва на дванадесетопръстника е открита само при две от шест животни (33%), заразени с TN2GF4 на 14 седмици, и в нито една от групите ATCC 43504 или K-6. Освен това не е открита язва при животни, заразени на пет седмици, независимо от щама. Тези резултати могат да обяснят защо язва на дванадесетопръстника не е наблюдавана в предишни изследвания 13, 14, които са използвали щама ATCC 43504 за заразяване на гербили с H pylori на възраст 4-5 седмици. По неизвестни причини животните от тази възрастова група и щамът ATCC 43504 изглежда не са подходящи за индукция на язва на дванадесетопръстника.

Атрофия на жлезата и чревна метаплазия са открити при монголски гербили, 26 седмици след инокулация с H pylori. 23 В нашето проучване обаче наблюдавахме заразените животни в продължение на 12 седмици след инокулацията и не бяха открити нито атрофия, нито чревна метаплазия в стомаха. Hansson et al съобщават, че язвената болест на дванадесетопръстника има защитен ефект срещу развитието на рак на стомаха. 24 Тъй като всички язви на дванадесетопръстника в настоящото проучване са били едновременно със стомашни язви, този модел не е полезен за проверка на този защитен ефект.

Някои пациенти със стомашни язви също имат или са имали язва на дванадесетопръстника, а честотата на съпътстващи язви на стомаха и дванадесетопръстника варира от 7% до 64%. 25 Наскоро, казус съобщава, че инфекцията с H pylori носи най-силна връзка с гастродуоденална язва в сравнение със стомашна язва в стомашното тяло и препилорната област. 26 В повечето случаи се смяташе, че язвата на дванадесетопръстника е основното заболяване, като стомашната язва се появява вторично, но едно проучване показва, че стомашната язва е основното заболяване при някои пациенти. 27 В настоящото проучване установихме, че стомашната язва е основното заболяване поради гастрит, свързан с H pylori, и язва на дванадесетопръстника се появява рядко в относително ранна фаза, 12 седмици след инфекция с H pylori. Това може да е причината, поради която язвите на дванадесетопръстника са били повърхностни и не са били чести в нашия модел. Nord et al съобщават, че стомашна антрална язва, но не и стомашна язва или дуоденална язва, е открита при дете на възраст под три години. 28 Те също така показаха, че язва на дванадесетопръстника е забелязана за първи път при петгодишно дете и става все по-честа с увеличаване на възрастта. Това може да прилича на нашите резултати, при които са открити язви на дванадесетопръстника при две зародиши, инокулирани на 14 седмици със щама TN2GF4, но нито един на пет седмици.

Известно е, че инфекцията с H pylori се среща предимно в детска възраст, а новата инфекция при възрастни е рядка. 29 Епидемиологичните проучвания на H pylori както чрез серологични, така и чрез дихателни тестове на урея показват, че инфекцията често се придобива в детска възраст 30–32 г. и степента на придобиване в зряла възраст е много ниска. 33, 34 В това проучване степента на заразяване с H pylori е висока (100%) и подобна както при незрели, така и при зрели гербили. В това отношение моделът на монголските гербили не може да се сравни с инфекция с H pylori при човека.

В заключение, гастрит, стомашна язва и аденокарцином, които имитират човешка инфекция с H pylori, са били предизвикани от инокулация с H pylori в монголския гербил. В допълнение, както дуоденит, така и язва на дванадесетопръстника са индуцирани от инфекция с Н pylori по начин, зависим от възрастта и щама. Това отговаря на изискванията на постулатите на Koch за установяване на ролята на H pylori като причинител на язва на дванадесетопръстника и утвърждава моделна система за изследване на това заболяване. Честотата на поява на язва на дванадесетопръстника не е била значителна по отношение на контролите; необходим е по-голям брой животни, за да се определи значението му.