Резюме

Заден план

Сковаването на съдовете, рисков фактор за сърдечно-съдови заболявания, се ускорява, особено при жени със затлъстяване и диабет тип 2. Предклиничните данни сочат, че инхибиторите на дипептидилпептидаза-4 (DPP-4) могат да имат сърдечно-съдови ползи, независимо от гликемичните понижаващи ефекти. Последните проучвания показват, че консумацията на западна диета (WD) с високо съдържание на мазнини и прости захари предизвиква сковаване на аортата при женски мишки C57BL/6J преди повишаване на кръвното налягане. Целите на това проучване бяха да се определи дали приложението на DPP-4 инхибитора, линаглиптин (LGT), предотвратява развитието на аортна и ендотелна скованост, индуцирана от WD при женски мишки.

Методи

C56Bl6/J женски мишки са хранени с WD в продължение на 4 месеца. Сковаността на аортата и сковаността на ендотел ex vivo бяха оценени чрез скорост на импулсна вълна на Доплер (PWV) и микроскопия на атомна сила (AFM), съответно. Освен това изследвахме аортните вазомоторни отговори и маркери за ремоделиране чрез имунохистохимия. Резултатите бяха анализирани чрез двупосочна ANOVA, p

Заден план

Методи

Модели на животни

Телесно тегло

За да се оцени теглото, натрупано по време на 4-месечния експеримент, мишките се претеглят непосредствено преди началото на експеримента на възраст 4 седмици и преди умъртвяването.

Анализ на активността на DPP-4

Анализът на активността на DPP-4 се извършва, както е описано по-горе [15]. Накратко, кръвта беше събрана по време на убиването в епруветки с EDTA и плазмата беше съхранявана при -80 ° C. 20 μL плазма се разрежда в DPP-4 буфер за анализ и се добавя субстрат, 200 М H-Ala-Pro-AFC (I-1680; Bachem). Флуоресценцията беше измерена с четец на Synergy Microplate при дължина на вълната на възбуждане 405 nm и дължина на вълната на излъчване 535 nm [15].

Скованост на аортата чрез in vivo скорост на импулсна вълна (PWV)

Доплер ултразвук (Indus Mouse Doppler System, Webster, TX) е извършен под анестезия на изофлуран, съгласно предварително установен протокол [9], за да се оцени PWV за in vivo определяне на артериалната скованост. PWV се влияе от възрастта, кръвното налягане и сърдечната честота. Следователно, PWV се отчита както в m/s (некоригирано), така и нормализирано до сърдечната честота (HR). Ограничаването на периода на хранене с WD до 4 месеца ни позволи да избегнем каквито и да е ефекти от повишеното кръвно налягане върху съдовата скованост, тъй като 4 месеца WD не предизвикват повишаване на кръвното налягане при женски мишки C57BL/6J [9].

Ex vivo вазомоторни отговори в аортата

Аортните вазомоторни отговори бяха изследвани, както е описано по-рано [9]. Накратко, съдовете бяха предварително свити с U46619 (100 nM) и отговорите на ацетилхолин (ACh) (1 nm до 100 μmM) и на инсулин (INS: Novolin R, Novo Nordisk; 0.1–300 ng/ml) бяха оценени чрез кумулативно добавяне на агонист към изолирана съдова баня, както е описано по-рано [9]. В края на всеки експеримент разтворът за вана PSS се заменя с PSS без Ca 2+, за да се определи максимална релаксация.

Атомна силова микроскопия (AFM) за измерване на сила и изчисляване на твърдостта

AFM се използва за оценка на сковаността на ECs в преградите на аортните препарати на гръдната аорта, както е описано по-рано [9]. Сковаността (модул на еластичност) на повърхността на ЕС се измерва чрез AFM, като се използва протокол за наноиндентиране [9].

Ремоделиране на аортата и количествено определяне на протеини

Сегмент от гръдната аорта беше фиксиран в 3% параформалдехид, дехидратиран, вграден парафин и напречно разделен в 5 µm филийки. За да се оцени периаортната фиброза, както беше описано по-горе, срезовете бяха оцветени с пикро сириус червено. За да се оцени средната дебелина срезовете бяха оцветени с Verhoeff-von Gieson [9]. Интензитетът на розовите цветове и областите бяха количествено определени като „средни интензитети на сивата скала“ в пет изображения на мишка със софтуера MetaVue. Аортният оксидативен стрес се оценява чрез количествено определяне на кафяв цвят в ендотел, среда и адвентиция на аортата, което е показателно за образуването на 3-нитротирозин (разреждане 1: 150; Millipore, Billerica, MA), както е описано по-горе [16]. Нивото на експресия на фибробластен растежен фактор-23 (FGF-23) (разреждане 1:50; Novus NBP1-55830), клото (разреждане 1: 100; Novus NBP1-76511) и крайни продукти за усъвършенствано гликиране (AGE) (1: 100 разреждане; Abcam ab23722) се определя чрез количествено определяне на интензитета на сигнала върху флуоресцентните изображения на различните компоненти на аортата като „среден интензитет на сивата скала“.

Трансмисионна електронна микроскопия (TEM)

TEM се извършва, както е описано по-рано, използвайки JEOL 1400-EX TEM за определяне на ултраструктурни промени, свързани с повишена съдова скованост [17]. Накратко, аортните проби бяха събрани и фиксирани в 2% глутаралдехид/2% параформалдехид, последвано от вторично фиксиране с 1% осмиев тетроксид, вграден в смолата на Epon-Spurr, разделен на 85 nm и оцветен с уран ацетат/тройно оловно петно ​​на Сато.

Статистически анализ

Резултатите се отчитат като средната стойност ± SE. Статистическият анализ беше предимно чрез двупосочен ANOVA, последван от post hoc t тестове (Bonferroni), за да се изследват разликите в резултатите между мишки, хранени с CD или WD и администрирани LGT в мишка, или без LGT в чау (Sigma Plot 13.0, Systat Software) . Отговорите на аортния дилататор се представят като процент максимална релаксация, изчислена като [(Fb − Fd)/(Fb − Fmin)] * 100, където Fd е сила след лекарствена намеса, Fb е изходна сила и Fmin е минимална сила, получена по време на пасивна условия.

Резултати

Телесно тегло, плазмена активност DPP-4 и AGE

Телесното тегло на 20-седмичните мишки WDC и WDL е с подобни тегла и по-тежко в сравнение с тези на съответните им слаби колеги (Допълнителен файл 1: Таблица S1; Фиг. 1а). Процентът наддаване на телесно тегло през 4-месечния период на изследване е бил съответно 71 ± 4 и 93 ± 6% за CDC и WDC (p> 0,05) и 74 ± 7% и 88 ± 7% за CDL и WDL (p> 0,05), съответно. По този начин инхибирането на DPP-4 не оказва значително влияние върху телесното тегло (Допълнителен файл 1: Таблица S1; Фиг. 1а) в рамките на всеки хранителен режим по време на тестовия период. Както се очаква, плазмената активност на DPP-4 е значително намалена и в двете групи, лекувани с LGT, без диетичен ефект (фиг. 1б). Тъй като AGE са свързани със съдова скованост в някои модели на инсулинова резистентност [18, 19], ние изследвахме наличието на AGE в аортната стена (фиг. 1в). WD значително увеличава натрупването на AGE в съдовата стена и това не се влияе от приложението на LGT.

инхибирането

DPP-4 инхибирането предотвратява индуцирана от WD аорта и скованост на аортата

In vivo

PWV се определя при мишки след четири месеца на CD или WD (фиг. 2а). PWV не се различава значително при CDC мишки (Фиг. 2а; Таблица 1). PWV е повишен в групата на WDC в сравнение с CDC (p Фиг. 2

Ex vivo

Наскоро съобщихме за повишена скованост на ЕС в аортни експланти, използващи AFM след 4 месеца WD при женски мишки [9]. По същия начин, в това разследване наблюдаваме повишена твърдост на повърхността в ЕС от мишки, хранени с WD (p 0,05 за CDC срещу WDL) (Фиг. 2b).

Инхибирането на DPP-4 подобрява ендотелните реакции в аортата

Наскоро съобщихме, че 4-месечно хранене с WD при женски мишки C57BL/6J индуцира нарушена сигнализация на протеин киназа В (Akt)/ендотелна азотна оксид синтаза (eNOS) и това е свързано с нарушена аортна ендотелна зависимост вазодилатация [9]. Тук ние оценяваме Akt/eNOS сигнализирането в аортните пръстени чрез функционален анализ, за ​​да изследваме вазодилататорните реакции към ACh и инсулин. Четири месеца хранене с WD доведоха до нарушени аортни ендотелиозависими вазодилататорни отговори към ACh и инсулин в WDC в сравнение с CDC (фиг. 3а, b). Тези дефекти са предотвратени в групата WDL (Фиг. 3а, б).

Инхибирането на DPP-4 предотвратява съдовото ремоделиране

По-рано показахме, че храненето с WD води до повишено ремоделиране на аортата. По същия начин, в настоящото изследване, медиалната дебелина на аортата и фиброзата са значително увеличени при хранене с WD в сравнение с CDC (Фиг. 4а-d). Важното е, че аортната фиброза и увеличената медиална дебелина са предотвратени с инхибиране на DPP-4 (Фиг. 4a – d).

Инхибирането на DPP-4 предотвратява увеличаването на индуцираните от WD промени в ултраструктурата в ЕС

Повишеното активиране на съкратителния апарат на ЕС е свързано с генезиса на съдова скованост [20]. В това проучване ние изследвахме ултраструктурните характеристики на аортата в различните експериментални групи (фиг. 5а-г). WD е свързан със загуба на луминално ендотелно удължаване на цитоплазмата и ядрено свиване и тези аномалии са предотвратени в групата на WDL (Фиг. 5в, d).

Лечението с LGT подобрява загубата на луминално EC удължаване на цитоплазмата и ядрената контракция, предизвикана от WD. а, б изобразяват CDC и CDL кохорти с нормални EC характеристики; ° С изобразява контрактирана цитоплазма и ядра на EC в WDC; д демонстрира липсата на луминален EC подуване, оток и свита цитоплазма и ядра, наблюдавани в ° С. Увеличение × 800; лента 2 µm. EL еластична ламина, IEL вътрешна еластична ламина, н ядро на луминална ендотелна клетка, VSMC съдова гладка мускулна клетка

Инхибирането на DPP-4 предотвратява оксидативния стрес

По-рано показахме, че съдовата скованост, предизвикана от хранене с WD при жени, е свързана с повишен съдов оксидативен стрес [9]. Тук показахме, че WD повишава аортния оксидативен стрес, оценен от наличието на 3-нитротирозин имунооцветяване (Фиг. 6). Важно е, че инхибирането на DPP-4 подобрява аортния оксидативен стрес чрез нормализиране на 3-нитротирозин, индуциран от WD хранене (Фиг. 6).

DPP-4 инхибирането предотвратява индуцирани от WD промени в FGF-23 и експресията на Klotho в съдовата стена

FGF-23 е свързан с артериална скованост и повишен риск от ССЗ [21-23]. Наскоро показахме, че тази парадигма за хранене с WD води до повишен FGF23 в съдовата стена [24]. Освен това е известно, че намалената експресия на Klotho, друг протеин, участващ в съдовата калцификация, влошава индуцираната от диетата съдова скованост [9]. Тук изследвахме дали WD индуцира промени в експресията на FGF-23 и Klotho в аортата и ако е така, дали инхибирането на DPP-4 предотвратява тази промяна (Фиг. 7). Както се очакваше, наблюдавахме значително увеличение на FGF-23 в аортния ендотел и адвентиция на групата WDC в сравнение с CDC и това увеличение беше предотвратено в групата WDL (Фиг. 7а-c). В допълнение, експресията на Klotho е значително намалена чрез хранене с WD и инхибирането на DPP-4 предотвратява този дефицит в съдовата стена (Фиг. 7d – g).

Дискусия

Колективно резултатите от това изследване подкрепят хипотезата, че активирането на DPP-4 играе важна роля в развитието на аортна скованост при женски мишки в условията на индуцирана от WD инсулинова резистентност. Освен това представяме доказателства, че инхибирането на DPP-4 е попречило на женски мишки C57BL/6 J да развият втвърдяване, ремоделиране и дисфункция, индуцирано от WD. По-рано съобщихме, че храненето с WD в продължение на 4 месеца не повишава кръвното налягане при жените C57BL/6J [9]. Тази предишна констатация ни позволи да проектираме експеримент, който отчете потенциален ефект на кръвното налягане, за да обясни CV защитните ефекти на инхибирането на DPP-4.

Благоприятните съдови ефекти на инхибирането на DPP-4 се дължат както на директните ефекти на инхибирането на DPP-4, така и на допълнителното увеличение на наличността на глюкагон като пептид-1 (GLP-1) [10]. В съда DPP-4 се намира в цитоплазматичната мембрана както на ЕС, така и на съдовите гладкомускулни клетки (VSMC). При EC експресията на DPP-4 се увеличава при модели на диабет [25], а при VSMC експресията на DPP-4 се увеличава за предпочитане в условията на съдово ремоделиране [11]. Важно е, че дозата LGT, използвана в нашето разследване, значително инхибира активността на DPP-4 [12, 14, 26].

Преди това нашата група показа, че 4-месечното хранене с WD при женски мишки води до увеличаване на сковаността на аортата, измерена неинвазивно, както и скованост на ЕС, измерена ex vivo [9]. Резултатите от това проучване, използващо отделна кохорта от мишки, бяха почти идентични с нашия предишен доклад и допълнително демонстрират втвърдяване на аортата и ЕС след 4 месеца хранене с WD. По-специално, инхибирането на DPP-4 предотвратява развитието на скованост на аортата, както in vivo, така и ex vivo, наблюдавано при нелекувани WD-хранени мишки. Въпреки че предишните доклади показват, че инхибиторите на DPP-4 намаляват сърдечната скованост [12, 27, 28], доколкото ни е известно, това е първият доклад, демонстриращ защита от сковаване на съдовете в клинично значим недиабетичен женски модел на прекомерно хранене.

По същия начин, благоприятната роля на инхибирането на DPP-4 за възстановяване на ендотелно-зависима вазодилатация в условия на повишен оксидативен стрес е документирана в други миши модели [33, 34]. Трябва да се отбележи, че макар и големината на аортните вазодилататорни реакции, съобщени в това разследване, да изглежда ниска, подобни резултати при мишки са докладвани от други лаборатории [35–37]. Освен това, нашите ултраструктурни открития предполагат, че инхибирането на DPP-4 обръща загубата на луминални ендотелни удължения на цитоплазмата и ядреното свиване, свързано с храненето с WD. Освен това, нашите открития показват, че благоприятните ефекти от инхибирането на DPP-4 не се ограничават до ендотела. Тук забелязахме, че инхибирането на DPP-4 намалява медиалното удебеляване и фиброзата, свързани с храненето с WD. Съдовата антифиброзна роля на DPP-4 инхибиторите е докладвана по-рано при модели на атеросклероза и увреждане на нео-интима [34, 38].

За да обобщим, настоящото разследване показва, че инхибирането на DPP-4 предотвратява необичайно увеличаване на съдовата скованост, аортна фиброза, оксидативен стрес и експресия на FGF-23/Klotho, индуцирано от WD при женски мишки и тези предимства се проявяват независимо от намаляването на AGE. Нашите открития имат клинично значение, тъй като затлъстелите жени с диабет са по-често засегнати от повишена съдова скованост, която вероятно насърчава по-често инцидентно ССЗ в сравнение с техните мъже. В крайна сметка само резултатите от добре проектирани клинични проучвания ще изяснят ролята на LGT при лечението на СДЗ при диабет.