Публикувано: 9 декември 2015 | Стефан Шварцингер, Феликс Брауер и Пол Рьош, Изследователски център за био-макромолекули, Университет Байройт, ALNuMed GmbH/Bernd Kämpf, FoodQS GmbH, Markt Erlbach | 1 коментар

Мед - в продължение на хиляди години той е единственият източник на сладък вкус и все още е прототип на изцяло естествена, здравословна храна. По-специално с нарастващите тенденции към органична храна и здравословен начин на живот медът се радва на постоянно нарастваща популярност. За съжаление, докато търсенето нараства, предлагането е малко. Причините за това са сложни и преплетени и водят началото си от болестите на пчелите, изменението на климата, както и методите на агропромишленото производство. В резултат на това в международната търговия е открит все по-голям брой мед, смесен с неестествени сладки сиропи. Такова икономически мотивирано фалшифициране се наблюдава и при други храни като плодов сок, зехтин или вино и е най-надеждно изложено чрез NMR профилиране. Тази технология се основава на сравнението на стотици спектрални характеристики на автентичния мед с пробата, която ще бъде тествана ...

храни

Благодарение на специалната си роля на сладка храна в развитието на човечеството, медът днес се ползва със специална защита от закона 1. Сериозните проблеми в производството на мед обаче допълват нарастването на търсенето на мед. Сложна комбинация от фактори, включително акарите Varroa, които натоварват пчелните семейства чрез пренасяне на други пчелни патогени и интензификацията на селскостопанското производство с ескалираща употреба на торове, пестициди и инсектициди, доведоха до феномен, наречен разстройство на колапията на колониите (CCD) . CCD доведе до загуби на над 80% от кошерите в определени случаи през последните години 2. В допълнение, променящият се климат влияе върху производството на мед, както се наблюдава, например, през 2014 г., когато дългите периоди на дъжд през сезона на цъфтежа водят до пълна загуба на производство в някои европейски страни.

Икономически мотивирано нарастване на фалшификатите при нарастване Недостигът на производство води до повишаване на цените, което от своя страна поражда нарастващ брой фалшифицирани медове на пазара. В конкретния случай на мед автентичният продукт се разрежда с различни захарни сиропи, които се произвеждат в индустриални мащаби, например от царевица, ориз или пшеница, като част от цената на меда. Смесени продукти или продукти с отстранен прашец са строго забранени на европейския пазар, но се приемат другаде и по този начин участват в световната търговия. Икономически мотивираното фалшифициране включва не само смесване на мед с евтини сиропи, но се простира до прикриване на географския произход на определен мед, вид измама, известна като „пране на мед“. Прането на мед стана публично достояние наскоро в скандала „Honeygate“ в САЩ, където медът от Китай беше погрешно деклариран в голям мащаб, за да замъгли страната си на произход. Говори се, че загубените акцизи достигат 180 милиона щатски долара 3. За допълнително скриване на географския произход на продукта - обикновено тестван чрез анализ на поленовия спектър - поленът все повече се филтрира от меда, което - от друга страна - е лесно да се провери.

Фалшифицирането на мед със захарни сиропи от растителен произход, напротив, е аналитично много взискателно за доказване. По същество медът, състоящ се предимно от двата моно-захарида глюкоза и фруктоза, е подправен с основните му съставки. Сиропите от така наречените С4-растения, като царевица или тръстика, показват различно съотношение на стабилните изотопи на въглерод, 12 С и 13 С, което може да бъде доказано чрез масова спектрометрия (IRMS) със стабилно изотопно отношение, метод, който се използва рутинно при анализ на мед 4. Добавянето на сиропи с произход от пшеница, ориз и други С3-растения не може да бъде открито по същия метод. За да се гарантира автентичността на меда, днес обикновено се прилага комбинация от няколко аналитични метода, която включва IRMS, откриване на немедени олиго-захариди, ензими, използвани в производството на индустриален сироп, както и маркери с малки молекули за чужди сиропи. В допълнение, специални вещества могат да се използват за тестване за автентичност, изискващи набор от различни аналитични техники. Всичко това отнема много време и е скъпо; на по-сложни въпроси като тези, свързани с произхода на храната, изобщо не може да се отговори само чрез количествено определяне на ограничен набор от вещества.

NMR пръстовите отпечатъци доказват качество, автентичност и разкриват фалшификация само с едно измерване

Съответно, систематичните разлики в концентрацията на редица метаболити могат да бъдат обобщени в модел, който може да се използва като маркер за географски произход или отсъствие на незаконни фалшификации. По този начин, ЯМР-спектърът на неизвестна проба може да бъде сравнен със спектри от автентични референтни проби чрез автоматични методи. След това тези математически процедури могат да се използват за класифициране на нови и неизвестни проби чрез сравнение с референтната база данни. Процедурата вече се използва рутинно в FoodScreener TM (Bruker BioSpin, Rheinstetten, Германия) за плодови сокове (SGF-Профилиране TM) и вино (Wine-Profiling TM), където се получават значителен брой количествени качествени параметри, изисквани от регулаторните органи 5 . В допълнение, много нови параметри, характерни за напр. Сорт, произход, реколта, разграждане и обработка, могат да бъдат записани с пълна автоматизация по време на измерване от само 15 минути. Също така в случая на мед ЯМР спектроскопията предлага многофункционален инструмент за скрининг с много параметри за тестване за качество, автентичност и фалшификация с минимални времеви усилия и разходи.

Ключ към успеха - референтната база данни

Предпоставка за такъв анализ е създаването на достатъчно голяма база данни с референтни спектри на материал с доказана автентичност. Консорциум от няколко аналитични лаборатории, специализирани в анализи на мед и базиран на ЯМР производител на инструменти и доставчик на решения Bruker BioSpin работиха заедно за разработването на тази база данни като основна част от новата ТМ за профилиране на мед, която работи на базата на добре утвърдената FoodScreener TM платформа. Конвенционалният анализ е бил използван в подкрепа на съответствието на записите в базата данни. Следователно методите включват мелисопалинология (анализ на полени) за проверка на ботаническо разнообразие и географски произход, класически качествени параметри като глюкоза, фруктоза, HMF, влага, pH, проводимост, ензимна активност, органични киселини, етанол, както и класическите методи за откриване на фалшификацията, както по-горе. За всяка автентична проба бяха определени общо до 18 различни параметъра.

Централна база данни и акредитация по ISO 17025

Работа с бутон: Автоматизацията е необходима за точни резултати

За сравнение на ЯМР спектрите, генерирани от лаборатории на трети страни, възпроизводимостта на спектрите е от първостепенно значение, както и лекотата на работа. Медът се разтваря и пробите се смесват с буфер за профилиране на вино Bruker BioSpin и рН се регулира прецизно с помощта на автоматизирана единица за титруване на рН Bruker. ЯМР спектрите се получават от стандартизирана платформа FoodScreener TM от Bruker BioSpin, работеща на 400MHz. Системата работи в бутонен режим и автоматично поема всички необходими стъпки за получаване на възпроизводими висококачествени спектри, включително настройка, съвпадение, уравновесяване на температурата, калибриране на широчината на импулса, както и спектрална обработка. По този начин се премахват специфичните за оператора влияния. Системата е под пълен контрол на LIMS система, която контролира работата на ЯМР спектрометъра и комуникира със сървъра в Bruker BioSpin, където се извършва автоматизираната спектрална обработка, оценка на данните и генериране на отчети.

Практическото приложение доказва: ЯМР пръстови отпечатъци, характерни за сорта и географския произход на меда и фалшификацията

От ключово значение е да се оценява мед по няколко критерия едновременно, които Honey-Profiling TM предоставя чрез едно измерване и в автоматично генериран доклад, интерпретиран от специалиста по храните. Това се демонстрира в три примера.

Първо, ние демонстрираме силата на Honey-Profiling TM да провери дадена страна на произход. Това е от нарастващо значение, тъй като страната на произход се използва все по-често в маркетинга и се декларира на етикета на бурканчето с мед. В много страни - ако е деклариран на етикета - медът трябва да произхожда изключително от тази посочена държава, което често оправдава по-висока цена. Например, когато в смес се използва мед извън ЕС, този мед не трябва да бъде етикетиран като произхождащ от страни от ЕС. Фигура 1 (страница 00) изобразява извадка от доклада за мед, където доставчикът е заявил България като държава на произход. Профилирането на мед TM продължава поетапно, първо тестване за региона на произход (тук Европа). Второ, ЯМР профилът на меда се сравнява с автентични проби от заявената държава на произход. Ясно може да се види в резюмето на светофара на доклада (Фигура 1А), че заявената държава на произход не съответства на референтната база данни. Въпреки че регионът на произход, Европа, може да бъде потвърден (Фигура 1В), държавата на произход не е България (Фигура 1С). Опитът показва, че фалшиво декларираният произход често е придружен от допълнителни манипулации, които не се откриват лесно.

Honey-Profiling TM също така позволява тестване за сорта без необходимост от анализ на полени. Например, лесно може да бъде открит цветен мед, обозначен като медена роса (Фигура 2, стр. 00). Не само статистическата класификация веднага идентифицира измамата (Фигура 2Б), Honey-Profiling TM също предоставя множество количествени параметри, укрепващи цялостния анализ. Сравнението с разпределението на разглеждания параметър в сравнение с референтната база данни се оказа особено полезно. Ясно може да се види, че концентрациите на глюкоза и сумата от глюкоза и фруктоза са твърде високи в сравнение с всички други медоносни медове, докато концентрацията на тураноза е твърде ниска в сравнение с референтното разпределение на меда от медена роса (Фигура 2С). Понастоящем Honey-Profiling TM може да класифицира медена роса и полифлорен мед, както и моноцветни сортове, например Manuka. За последния, който поради антибактериалната си активност е достигнал високи цени на пазара, се определят специфични маркерни съединения, корелиращи със стойността на този мед (MGO, DHA, фенилактова киселина), което позволява бърз анализ на този скъп мед.

Тестването за фалшифициране може да се направи и без тази информация, както е показано в Фигура 3. Тестваният полифлорен мед е доставен без допълнителна информация за възможния му произход. Резюмето на светофара на отчета за профилиране на мед веднага сигнализира за възможно добавяне на сироп. Чрез систематично сравнение на съотношението на голям брой ЯМР сигнали в автентични и доказани фалшифицирани пчелни медове беше изведен набор от индекси, които показват фалшифициране. Ако е нарушено, в доклада се прави съответна забележка. В случай, че в хода на едномерния анализ се открият допълнителни сигнали в пробата, които липсват във всички автентични мед (или обратно), се отчита съответната област в спектъра (Фигура 3В). В повечето случаи на добавяне на сироп в спектрите могат да се намерят ясни индикации, като наличие на повишени концентрации на олиго-захариди или малтоза или малтотриоза (Фигура 3С). За отбелязване е отклонението, изобразено в Фигура 3С произхожда от добавянето на оризов сироп, който не може да бъде открит чрез въглероден IRMS.

В обобщение, използвайки високо автоматизиран NMR подход в комбинация с внимателно сглобена централизирана база данни за автентични, както и известни фалшифицирани проби, е възможно чрез акредитирани по ISO 17025 нецелеви методи да се установят количествени молекулярни пръстови отпечатъци, характерни за естествения мед от различни сортове и различни произход. Важно предимство на този подход е фактът, че дори все още неизвестни фалшификации могат да бъдат открити чрез нецелеви едно- или многовариантни тестове. В допълнение, тъй като NMR е количествен за всички сигнали, открити над прагова интензивност, той също позволява целенасочен подход с множество параметри едновременно. Тъй като NMR обхваща аналитичните изявления на няколко метода, които обикновено се използват при тестване на качеството и автентичността на меда, това може да допринесе за спестяване на време и разходи, както и за създаване на недостъпна досега информация за автентичността и фалшификацията.

Авторите благодарят на д-р Manfred Spraul и д-р Birk Schütz (Bruker BioSpin), както и на г-жа Gudrun Beckh и д-р Arne Dübecke (QSI, Бремен) за много проницателни дискусии и Britta Zimmermann (ALNuMed) за експертна техническа помощ.

Препратки

Директива 2001/110/ЕО на Съвета от 20 декември 2001 г.

http://en.wikipedia.org/wiki/Varroa_destructor. Genersch, Е. et al. (2010) Германският проект за наблюдение на пчелите: дългосрочно проучване за разбиране на периодично високите загуби през зимата на пчелните семейства, Apidologie 41, 332–352. Sgolastra, F. et al. (2012) Ефекти на неоникотиноиден прах от превръзка на царевичните семена върху медоносните пчели Бик. на насекомо. 65, 273–280

Elflein, L., Raezke, K.-P. (2008) Подобрено откриване на фалшифициране на мед чрез измерване на разликите между 13C/12C стабилни съотношения на въглеродни изотопи на протеинови и захарни съединения с комбинация от елементален анализатор - масова спектрометрия на съотношение изотоп и течна хроматография - масова спектрометрия на съотношението изотопи (δ13C-EA/LC- IRMS), Apidologie, 39, 574-587

Spraul, М. и сътр. (2009) ЯМР-базиран многопараметричен контрол на качеството на плодовите сокове: SGF профилиране, хранителни вещества 1, 148–155. Godelmann, R. et al. (2013) Целеви и нецелеви анализ на виното чрез (1) h NMR спектроскопия, комбинирана с многовариатен статистически анализ. Диференциация на важни параметри: сорт грозде, географски произход, година на реколтата, J. ​​Agric. Храна Chem. 61, 5610-5619

Относно авторите

Стефан Шварцингер учи техническа химия в комбинация с бизнес администрация в Университета в Линц, завършвайки докторат там през 1999 г. Това е последвано от период на докторантска работа в The Scripps Research Institute, La Jolla, CA, преди да се присъедини към катедрата по биополимери в университета в Байройт през 2000 г., където завършва хабилитацията си през 2006 г. по биофизична химия. През 2008 г. служи като временен ръководител на Катедрата по биохимия в университета в Байройт. Член на изследователския център на BIOmac от 2010 г., той е доцент там от 2013 г. Той е и главен изпълнителен директор на ALNuMed GmbH. Неговите изследователски интереси включват ЯМР методи за характеризиране на гъвкави протеини, ЯМР-базирани анализи на храни и прилагане на комбинирани методи за анализ.

Бернд Кемпф учи химия на храните във FH Isny. От 1999 г. е ръководител на лабораторията и ръководител на осигуряване на качеството в Breitsamer и Ulrich. 2014 г. е назначен за изпълнителен мениджър на FoodQS. Неговите интереси са в областта на анализа на меда, по-специално анализа на остатъците.

Феликс Брауер завършва следдипломно обучение по биохимия и магистър по биохимия и молекулярна биохимия в университета в Байройт. Работи като научен сътрудник в ALNuMed GmbH и докторант в RC BIOmac от 2013 г. Научните му интереси включват ЯМР-базиран анализ на храните и интеграция на методи, използвани в метабономиката и спектроскопското профилиране.

Пол Рьош учи физика в университетите в Карлсруе и Хайделберг, преди да получи докторат в Института за медицински изследвания Макс Планк в Хайделберг. Последва пост-доктор в Медицинското училище в Университета на Пенсилвания в САЩ и пост като научен сътрудник в Института за медицински изследвания Макс Планк в Хайделберг. През 1989 г. завършва хабилитацията си по биофизика в университета в Хайделберг. Той е ръководител на отдела за биополимери от 1990 г. и изпълнителен директор на Изследователския център за био-макромолекули (RC BIOmac) към Университета в Байройт от 2007 г. Основните му области на изследване са базирани на ЯМР биомедицински структурни изследвания, като се фокусира по-специално на молекулярна основа на хранителни алергии и изследване на бактериалната транскрипция като цел за нови антибиотици.