• Намерете този автор в Google Scholar
  • Намерете този автор в PubMed
  • Потърсете този автор на този сайт
  • За кореспонденция: [email protected]

РЕЗЮМЕ

ВЪВЕДЕНИЕ

Бактериоцините (BCN) са протеини с ниско молекулно тегло, които се произвеждат от бактериални рибозоми и притежават антимикробни свойства (2, 5, 8, 14, 15). Тези протеини са предимно катионни, хидрофобни или амфифилни пептиди, с молекулни маси от 5 до 6 kDa. Зрелите бактериоцинови антимикробни средства се състоят от 20 до 60 аминокиселини (14, 15). Бактериоцините се произвеждат от много различни микроорганизми, които принадлежат към различни систематични групи и заемат различни екологични ниши. Съгласно широко приетата класификация (8), подклас IIa носи педиоциноподобни анти-листерийни пептиди, които имат запазена N-терминална последователност на YGNGV и един или два цистеинови моста.

lactobacillus

Многобройни аспекти разграничават бактериоцините от антибиотиците (2). (i) Бактериоцините се произвеждат на повърхността на рибозомите в микробните клетки, докато антибиотиците са предимно вторични метаболити на клетката. (ii) За разлика от производителите на антибиотици, производителите на бактериоцин са нечувствителни към бактерицидните ефекти. (iii) Молекулите на бактериоцин могат да се прикрепят към прицелната клетъчна стена навсякъде по повърхността, тъй като очевидно не съществуват специфични рецептори на прицелната клетъчна стена. (iv) Механизмът на бактериоцин за леталност е универсален и е свързан с процеса на образуване на пори във външната клетъчна мембрана. Бактериоцините се свързват с клетъчните стени на податливи микроби, причиняват йонни дисбаланси и генерират пори. Неорганичните йони изтичат през порите, като по този начин убиват целевата клетка. Антибиотиците, от друга страна, могат да инхибират синтеза на субклетъчните процеси (синтез на клетъчната стена, производство на вътреклетъчен протеин и репликация на ДНК и РНК). (v) Ограничена устойчивост на прицелната клетка към бактериоцини се развива, когато прицелът променя химичния си състав на клетъчната мембрана.

Бактериоцините имат предимства пред антибиотиците. (i) Няма информация, която да предполага, че бактериоцините са токсични за животните или се натрупват в тъканите. Бактериоцините са податливи на протеази и трябва да се разграждат в гостоприемника. (ii) Бактериоцините са ефективни срещу устойчиви на антибиотици патогени (24). (iii) Бактериоцините вече се произвеждат в животни-гостоприемници от нормална микрофлора и вероятно играят важна роля в кинетиката на микробната екосистема. (iv) Потребителите желаят естествено отгледани и преработени храни. Забрана на Европейския съюз за внос на домашни птици, третирани с хлорирана вода, е в сила от 1997 г. и ограничава вноса на птиче месо от САЩ, което обикновено се обработва от този процес. Прилагането на бактериоцини би осигурило алтернатива на подходите за химическа дезинфекция, които се използват в момента.

Тази статия описва откриването, характеризирането и ефективността на нов бактериоцин, L-1077, произведен от Lactobacillus salivarius L-1077 (NRRL B-50053). Ние също така демонстрираме едно потенциално приложение на този бактериоцин като терапевтичен агент, прилаган на пилета бройлери в пазарна възраст в питейна вода за ефективен контрол както на Campylobacter jejuni, така и на Salmonella при живото животно.

МАТЕРИАЛИ И МЕТОДИ

Микробиология. В руски завод за клане/преработка здрави пилета за бройлери, служещи като донори на цекално съдържание, осигуряващи антагонистична флора. Тези материали бяха нанесени върху агар на млечнокисели бактерии (de Man, Rogosa и Sharpe [MRS]; Difco) и инкубирани в анаеробна атмосфера за една нощ при 37 ° С. Колониите на лактобацили са изолирани и идентифицирани със системата за микротестове API 50 CHL (bioMérieux, Франция). Изолатите се отглеждат анаеробно при 37 ° С за една нощ до сливане на MRS агар. Агаровите блокове (~ 0,5 cm 3), съдържащи израстъка, бяха асептично нарязани и прехвърлени в бруцела агар, допълнен с 5% лизирана кръв, посята с C. jejuni NCTC 11168. Плаките бяха инкубирани при 42 ° С под микроаеробна атмосфера за 24 до 48 часа. Отбелязани са зони на инхибиране на растежа и са измерени диаметрите.

Пречистване на бактериоцин L-1077. Изолатът създава зона на инхибиране и Lactobacillus salivarius L-1077 (NRRL B-50053) се изолира за по-нататъшно проучване. В съответствие с методите, описани по-рано (21, 25), BCN се произвежда и пречиства до хомогенност. Изолатът беше ферментирал през нощта в 10% (обем/обем) бруцела бульонна среда при спокойни аеробни условия, поддържани при 37 ° С. Изхабената култура се центрофугира (10 000 х g, 10 минути) за отстраняване на клетките. Супернатантът се регулира до рН 6,2 чрез добавяне на 1 N NaOH и 130 U/ml каталаза, за да се премахне влиянието на органичните киселини и водородния прекис. Протеините в безклетъчната супернатанта се утаяват с амониев сулфат и след това се диализират, както е описано по-горе (23). Суровият препарат беше филтриран през 0.22-μm филтър (Millipore, Bedford, MA) и допълнително пречистен чрез катионообменни и хидрофобни взаимодействия хроматографски сепарации (23).

Биопроби и химически анализи. Дейностите на хроматографските фракции първоначално бяха скринирани срещу C. jejuni NCTC 11168. Допълнителни 32 широко разнообразни, патогенни бактериални изолати (вж. Таблица 2) бяха тествани за MIC (μg/ml). Определени са протеинови концентрации на фракциите (11). Бяха извършени удвояващи разреждания на препаратите и 10 μl от всяко разреждане бяха забелязани върху плочи с добавен с кръв бруцелен агар, посят преди това с клетки на C. jejuni NCTC 11168 или допълнителните бактериални изолати, както е описано по-горе (23). Всички анализи бяха проведени в два екземпляра.

Аминокиселинната последователност на пречистения бактериоцин беше определена чрез разграждане на Edman, използвайки 491 cLC автоматичен секвенсор (6) (Applied Biosystems). Молекулното тегло на бактериоцина се определя чрез масспектрометрия (MS), като се използва Voyager-DERP масспектрометър (Perkin-Elmer). Анализът с помощта на матрица за лазерна десорбционна йонизация – време на полет (MALDI-TOF) беше извършен съгласно инструкциите на производителя. След биохимичното определяне на първичната аминокиселинна последователност, физическите характеристики бяха анализирани, използвайки протеиновата функция на DNAStar (Madison, WI) (13). Първичната аминокиселинна последователност е въведена в базата данни BLAST (1) за търсене на протеини с подобни последователности.

Пилешки предизвикателства. Пречистеният бактериоцин се разрежда в чешмяна вода, за да осигури 25, 12,5 или 6,25 mg или никакъв бактериоцин L-1077/литър в опитни води за пиене на птици. Получихме птици от търговска възраст, които вече бяха колонизирани от C. jejuni чрез излагане на поле. 43-дневните птици бяха предизвикани с 0,2 ml суспензия от ∼10 10 до 10 11 CFU на Salmonella enterica serovar Enteritidis 92 Rif r. Устойчивият на рифампин изолат на S. Enteritidis е създаден чрез последователно преминаване върху среда, съдържаща нарастващи нива на рифампин. Щам S. Enteritidis 92 Rif r се култивира за една нощ в среда на Endo, съдържаща 100 μg/ml рифампин. Птиците са получили храна и вода ad libitum. На трите третирани групи бройлери беше осигурено едно от трите нива на бактериоцин L-1077 на литър в питейна вода за 3 дни. Във второто терапевтично проучване групи от 40-дневни бройлери, комерсиално колонизирани с C. jejuni и предизвикани със S. Enteritidis 92 Rif r, бяха лекувани в продължение на 1, 2 или 3 дни с 12,5 mg бактериоцин L-1077/литър в тяхната питейна вода.

Микробиологично вземане на проби. В определените часове (след ден 1, 2 или 3 от лечението) групи бройлери се умъртвяват и претеглят. Средните тегла на всички птици във всяка група, заедно с количеството вода, което те консумират, са използвани за оценка на общото средно количество бактериоцин, предоставено на групите бройлери. Птиците бяха дисектирани, за да премахнат асептично цека, черния дроб и далаците на животните. Охладените тъкани се връщат директно в лабораторията и се подлагат на 10-кратни серийни разреждания и се поставят върху следните среди и условия: (i) MRS агар за 24 часа при 37 ° C анаеробно, (ii) Campy-Cefex агар (19 ) за 48 h при 42 ° C микроаеробно, или (iii) Endo агар плюс 100 μg рифампин/ml за 24 h при 37 ° C аеробно, за да се определят нивата на млечнокисели бактерии, C. jejuni и S. Enteritidis, съответно.

РЕЗУЛТАТИ

Биохимично пречистване на бактериоцин L-1077 при използване на определени процедури

Стойностите на MIC, наблюдавани за 32 тествани патогенни бактерии, варират от 0,09 до 1,5 μg/ml (Таблица 2). Широката генетична панорама сред тези тествани чувствителни изолати е значителна. Много от тестваните Грам-отрицателни изолати се доближават до по-ниските стойности на MIC, които са докладвани, но Грам-положителните изолати на Listeria monocytogenes, Staphylococcus и Clostridium perfringens също проявяват чувствителност, подобна на чувствителността на бактериоцин L-1077. Всеки от тестваните изолати представлява последващи етиологични агенти, причиняващи различни човешки заболявания или патологични инфекции на птици и животни (9, 17).

Антимикробна активност на бактериоцин L-1077 срещу избрани патогени, както е определено с 10-μl спот тест

Терапевтичната стойност на бактериоцин L-1077 при бройлери, заразени с C. jejuni и Salmonella Enteritidis 92 Rif r е представена в таблици 3 и 4. Данните от първия експеримент са представени в таблица 3 и демонстрират ефективността на дозиране на птици с 5,5 до 21,3 mg/птица за 3 дни, за да се намалят драстично и двата агента. Бройлерите са тежали приблизително 2 кг, когато са взети пробите. В този експеримент нелекуваните контролни птици са били чревно колонизирани от C. jejuni над 10 6 CFU/g и от S. Enteritidis 92 Rif r над 10 8 CFU/g от цекула. Както паренхимните органи на черния дроб, така и далака на тези птици са колонизирани от S. Enteritidis 92 Rif r при ≥10 8 CFU/g. Млечнокиселите бактерии присъстват при ≥10 8,5 CFU/g от цекално съдържание. В групата птици, осигурени с 21 mg бактериоцин, C. jejuni не е открит в цеца на никоя от експерименталните бройлери. По същия начин присъствието и нивата на S. Enteritidis 92 Rif r в цека, черния дроб и далака на тези третирани птици бяха драстично намалени в сравнение с тези в групата на бройлери с положителен контрол.

Терапевтични ефекти на 3-дневно лечение с BCN L-1077, с различни концентрации, срещу смесена инфекция на Campylobacter jejuni и Salmonella Enteritidis 92 Rif r при бройлери на 43 дни

Терапевтични ефекти от 1 до 3 дни лечение с BCN L-1077 (12,5 mg/литър) срещу смесена инфекция на Campylobacter jejuni и Salmonella Enteritidis 92 Rif r при бройлери на възраст от 40 до 42 дни a

В последния експеримент, търговски птици в пазарна възраст, вече колонизирани с C. jejuni, също бяха предизвикани и колонизирани със S. Enteritidis 92 Rif r. Групи бройлери бяха третирани с 12,5 mg бактериоцин L-1077/литър питейна вода в продължение на 3-дневен период на изследване (Таблица 4). Намаление на 4-log10 в броя на C. jejuni в цекалното съдържание се наблюдава във всяка група през 3-те дни от лечението. Salmonella Enteritidis беше намалена по подобен начин с> 4 log10 в цеца след 1 ден лечение и допълнително намалена с два допълнителни дни лечение с бактериоцин до почти неоткриваеми нива. Три до 4-log10 S. Намаляване на ентеритидис се наблюдава както в пробите на черния дроб, така и в далака само след 1 ден лечение с бактериоцин, а по-нататъшни намаления настъпват с всеки допълнителен ден от лечението, достигайки неоткриваеми нива след 3 дни лечение. И накрая, броят на млечнокиселите бактерии в цекутата на лекуваните птици е приблизително същият като този, наблюдаван в контролната група, или дори има увеличение на плътността на клетките на тази обща бактериална група в тъканта.

ДИСКУСИЯ

Задължително е да се разработят нови иновативни подходи за контрол на причиняващите бактерии болестотворни агенти, причинени от храната, с широко наблюдаваното нарастване на антибиотичната резистентност сред всички бактериални групи (7, 12). Следователно, нашето изследване се фокусира върху търсенето на нови антимикробни средства с акцент върху бактериоцините, антимикробните пептиди, произведени от общо признати като безопасни (GRAS) бактериални образувания (10, 21, 23). Тези бактериоцини могат да бъдат използвани за контрол на бактериалните патогени в домашните птици и потенциално да имат положителни физиологични ефекти върху морфологията на червата на птиците (3). Бактериоцинът L-1077 може да бъде класифициран като педиоциноподобен антимикробен пептид от клас IIa, който съдържа мотива на аминокиселинната последователност YGNGV, но няма XCXXXXVXV последователности без остатъци C и V надолу по веригата. Следователно, L-1077 съдържа хидрофилната, катионна N-терминална "кутия за педиоцин", за която се предполага, че е свързващата част на клетъчната стена на молекулата (4). Въпреки че L-1077 има мотив YGNGV и структура, подобна на тази на други бактериоцини от клас II, той не е признат за подобен на други пептиди в базите данни чрез BLAST анализ. Следователно, това е друг нов пептид.

Описваме изолирането на антагонист на C. jejuni, изолат L. salivarius L-1077, който произвежда бактериоцин L-1077. Бактериоцинът се пречиства и се характеризира като антимикробен полипептид с дължина 37 аминокиселини с молекулна маса 3,454 Da. Изоелектричната точка на бактериоцин L-1077 беше pI 9.1 и неговата азотно-крайна аминокиселинна последователност на YGNGV беше показателна за неговото разпределение на клас IIa бактериоцин. MIC на бактериоцин L-1077 срещу 33 Грам-отрицателни и Грам-положителни бактериални изолати варират от 0,09 до 1,5 μg/ml. Терапевтичната полза от бактериоцин L-1077 е демонстрирана при бройлерни пилета от пазарна възраст, колонизирани както с C. jejuni, така и със Salmonella Enteritidis. В сравнение с нелекуваните контролни птици, броят на C. jejuni и S. Enteritidis в колонизирана цеца е намален с> 4 трупа, а броят на S. Enteritidis както в черния дроб, така и в далака на третираните птици е намален с 6 до 8 трупа/g по-долу тези в нелекуваните контролни птици. Изглежда, че бактериоцин L-1077 обещава да контролира C. jejuni/S. Enteritidis при пилета за бройлери с търговска цел.

ПРИЗНАВАНИЯ

Тази работа беше подкрепена от Държавния департамент на Съединените щати, Държавния изследователски център за приложна микробиология на Руската федерация (SRCAM), Министерството на земеделието и службите за селско стопанство на САЩ (USDA-ARS) CRIS проект Интервенции и методологии за намаляване на човешката храна Бактериални патогени при пилета 6612-32000-046-00 и Международен научно-технологичен център (ISTC) проект 1720.

Одобрението за провеждането на тези експерименти беше предоставено от Институционалния комитет за грижи и употреба на животните (PMS-03-03, „Контрол на Campylobacter в птицевъдството“).