Резюме

Изследвания, насочени към намаляване на нивата на холестерола в плазмата чрез инхибиране на диетичната абсорбция на холестерол, доведоха до развитието на езетимиб, който специфично намалява общата абсорбция на холестерол с 54% и води до 15% намаляване на плазмения LDL-холестерол (26). Проучвания, предназначени да определят механизма, чрез който езетимиб инхибира абсорбцията на холестерол, идентифицират Niemann-Pick C1-Like 1 (NPC1L1) като една от целите на езетимиб (8). Значението на NPC1L1 в пътя на усвояване на холестерола и неговото инхибиране от езетимиб е демонстрирано чрез експерименти, показващи, че Npc1l1 -/- мишките са намалили абсорбцията на холестерол и че остатъчната абсорбция на холестерол не е чувствителна към инхибирането на езетимиб (1). В допълнение, човешките вариации в модела на експресия на NPC1L1 корелират не само с тяхната ефективност на абсорбция на холестерол, но и с разнообразния им отговор на терапията с езетимиб (2, 24).

Тези проучвания документират значението на NPC1L1 в целия път на абсорбция на холестерола, процес, който включва поемане на холестерол от чревния лумен до лигавицата, естерификация и сглобяване на холестерол в хиломикрони в ентероцитите и секреция в лимфата. Не е ясно обаче дали NPC1L1 е необходим за усвояване на холестерол, както е предложено първоначално (1), и/или необходим за вътреклетъчен транспорт на холестерол до ендоплазматичния ретикулум (ER) за сглобяване на липопротеини, както се предлага от други проучвания (3, 21) . Целта на това проучване е да се изясни ролята на NPC1L1 в процеса на усвояване на холестерола, като се тества хипотезата, че NPC1L1 улеснява усвояването на холестерола, но не е необходим за транспортирането на вътрешния холестерол до ER за събиране на липопротеини.

МАТЕРИАЛИ И МЕТОДИ

Материали.

Холестеролът е закупен от Sigma (Сейнт Луис, Мисури). Радиоактивният [1,2-3 Н] холестерол, [4- 14 ° С] холестерол и [1,2-3 Н] холестерол етер са закупени от American Radiolabeled Chemicals (Сейнт Луис, МО). 22- (N (-7-нитробенц-2-окса-1,3-диазол-4-ил) амино) -23,24-биснор-5-холен-3β-ол (NBD-холестерол) е закупен от Invitrogen Molecular Сонди (Юджийн, ИЛИ). Езетимиб се получава под формата на таблетки Zetia, закупени от Merck Schering Plough (Whitehouse Station, NJ). NCS II Tissue Solubilizer е закупен от GE Healthcare (Питсбърг, Пенсилвания).

Животни и диети.

Мишките Npc1l1 -/- са генерирани, както е описано по-рано чрез насочване към гена Npc1l1 (3) и са прехвърлени в Университета в Синсинати, където са били отглеждани в дома. Животните, с изключение на случаите, когато е отбелязано друго, се поддържат на редовна чау диета. За животни, поставени на терапия с езетимиб, таблетките Zetia се смилат на прах и след това се смесват с храна в доза от 10 mg Zetia/100 g. Всички мишки бяха поддържани в рамките на 12: 12-часов цикъл светлина-тъмнина в помещение с контролирана температура и влажност в лабораторията за животни на Университета в Синсинати, със свободен достъп до храна и вода. Всички процедури, използвани в това проучване, са одобрени и одобрени от Институционалния комитет за грижа и употреба на животните в Университета в Синсинати. В тези проучвания са използвани само мъжки животни на възраст от 10 до 15 седмици.

Поглъщане на холестерол.

Тънкослоен хроматографски анализ на чревни проби.

Липидите в чревните проби на мишки, на които се прилага [3Н] холестерол, се екстрахират с хлороформ/метанол (2: 1, обем: обем) и след това се разделят върху плаки със силикагел, като се използва петролен етер-етилов етер-оцетна киселина (300: 150: 1.5) система с разтворители. Пробите се визуализират заедно със съвместимите референтни стандарти с йодни пари. Лентите на холестерилов естер (CE) и свободен холестерол (FC) бяха остържени и преброени. Процентът на естерифициран до СЕ холестерол се определя, като се използва следното уравнение: [Брой на СЕ/(Брой на FC + Брой на СЕ)] ​​× 100. NBD-холестеролът в червата на мишката след перорално приложение се екстрахира с хексан-вода (1: 1, обем/обем) и след това се разделят върху плаки със силикагел, като се използва система с разтворител петролев етер-етил-оцетна киселина (300: 150: 1,5, обем/обем). Пробите се визуализират чрез измерване на флуоресценция при 450 nm и се определят количествено чрез денситометрия. Процентът на естерифициран NBD-холестерол се определя, като се използва следното уравнение: [CE флуоресценция/(FC флуоресценция + CE флуоресценция)] × 100.

Количествено определяне на плазмения стерол.

Количественото определяне на NBD-холестерол е адаптирано от описания по-рано метод (25). Накратко, мишките на гладно през нощта се инжектират с 10% полоксамер (10 μl/g ip), за да инхибират липолизата и изчистването на циркулиращите липопротеини и след това се хранят незабавно с орален сондаж от [14 C] холестерол и 0,4 mg NBD-холестерол в зехтин . Мишките бяха евтаназирани чрез предозиране с изофлуран след 4 часа. Кръвта се събира чрез сърдечна пункция и след това се центрофугира за плазмена изолация. Абсорбцията на [14 С] холестерол се определя количествено чрез сцинтилационно броене на 10-μl плазмени проби. NBD-холестеролът се определя количествено чрез екстрахиране на 50-μl плазмена проба с хексан и вода (1: 1, обем/обем). Екстрахираните липиди се разтварят в 500 μl от 10 mM таурохолат за измерване на флуоресценция при възбуждане от 485 nm и емисия от 535 nm. Общата концентрация на NBD-холестерол във всяка проба се определя чрез сравняване на флуоресцентния интензитет със стандартна крива.

Статистически анализ.

Данните са представени като средни стойности ± SD. Статистическа значимост (P +/+ и Npc1l1 -/- мишки са перорално ваксинирани с болусно брашно от зехтин, допълнено с NBD-холестерол и след това са евтаназирани след 3 часа, за да се оцени приемането и транспортирането на NBD-холестерол в червата./+ мишки, перорално приложеният NBD-холестерол е открит главно в lamina propria на проксималните и средните отдели на червата (фиг. 1). За разлика от тях, NBD-холестеролът не е наблюдаван в чревния тракт на Npc1l1 -/- мишки (фиг. 1).

nbd-холестерол

Усвояване на 22- (N (-7-нитробенц-2-окса-1,3-диазол-4-ил) амино) -23,24-биснор-5-холен-3β-ол (NBD-холестерол) в ентероцитите на Niemann-Pick C1 Like-1 (NPC1L1) протеин-нула (Npc1l1 -/-) и Npc1l1 +/+ мишки. Представени са представителни изображения на 20 чревни секции от Npc1l1 +/+ (вляво) и Npc1l1 -/- (вдясно) мишки (n = 10 мишки на група) 3 часа след даване с 0,4 mg NBD-холестерол в 100 μl зехтин. Червата бяха фиксирани с 0.4% параформалдехид и вградени в среда за оптимална температура на рязане (OCT) преди флуоресцентна микроскопия. Изглежда, че NBD-холестеролът е локализиран към lamina propria при мишките Npc1l1 +/+, но не се вижда при мишките Npc1l1 -/-.

Приемане на NBD-холестерол в ентероцитите на Npc1l1 +/+ и Npc1l1 -/- мишки в присъствието на Pluronic L-81. Представени са представителни изображения на 20 чревни секции от проксималните (отгоре), средните (средните) и дисталните (долните) черва на Npc1l1 +/+ (вляво) и Npc1l1 -/- (вдясно) мишки (n = 10 мишки на група ) 3 часа след даване с 3,45 mg Pluronic L-81, последвано от 0,4 mg NBD-холестерол в 100 μl зехтин. Червата бяха фиксирани с 0.4% параформалдехид и вградени в ОСТ среда преди флуоресцентна микроскопия. NBD-холестеролът се съдържа в чревните липидни капчици както на Npc1l1 +/+, така и на Npc1l1 -/- мишки.

Холестеролът се естерифицира в Npc1l1 +/+ и Npc1l1 -/- мишки. A: Npc1l1 +/+ (плътни пръчки; n = 6) и Npc1l1 -/- (отворени пръчки; n = 7) мишки са хранени с диета от 1 μCi [3 H] холестерол в 100 μl зехтин и червата е събрани след 3 часа. Липидите се екстрахират и количеството на естерификация на холестерола се определя чрез тънкослойна хроматография. Процентът на естерификация на холестерола се определя чрез [СЕ преброяване/(FC преброяване + СЕ преброяване)] × 100. са хранени с 0,4 mg NBD-холестерол в 100 μl зехтин и кръвта е събрана след 4 часа. Плазмени липиди бяха извлечени за тънкослойна хроматография за разделяне на холестерол и холестерилови естери. Количеството NBD-холестерол, присъстващо във всяка лента, се определя чрез измерване на флуоресцентния интензитет при 488 nm. Процентът на естерификация се определя като [CE флуоресценция/(FC флуоресценция + CE флуоресценция)] × 100.

Поемане на [3 H] холестерол в червата на мишки Npc1l1 +/+ и Npc1l1 -/-. На мишките Npc1l1 +/+ (плътни) и Npc1l1 -/- (отворени пръти) е дадена доза от 3,45 mg Pluronic L-81, последвано от орално измерване на 1 μCi [3 H] холестерол в 100 μl зехтин. Червата се отстраняват, нарязват се на секции от 100 mg и се разтварят в тъканен разтворител преди определяне на радиоактивността. Данните представляват средно ± SE от 13 Npc1l1 +/+ и 10 Npc1l1 -/- мишки. * P +/+ мишки.

Ефект на Pluronic L-81 върху усвояването от червата на [3 H] холестеролов етер и [14 C] холестерол. A: На мишките Npc1l1 +/+ беше дадена доза от 3,45 mg Pluronic L-81, последвано от орално измерване на 1 μCi [14 С] холестерол (твърди стълбове) и [3 Н] холестеролов етер (отворени ленти). Червата бяха събрани, нарязани на 100 mg части и разтворени в разтворител на тъкани преди определяне на радиоактивността. В: На мишките Npc1l1 +/+ беше дадена доза физиологичен разтвор (излюпени ленти) или 3,45 mg Pluronic L-81 (отворени стълбове), последвано от орално измерване на 1 μCi [3Н] холестеролов етер. Червата бяха събрани, нарязани на 100 mg части и разтворени в разтворител на тъкани преди определяне на радиоактивността. Данните представляват средно ± SE от 3 мишки във всяка група. * P 3 H] данни за усвояването на холестерола.

Абсорбция на NBD-холестерол и [14 C] холестерол в Npc1l1 +/+, Npc1l1 -/- и третирани с езетимиб Npc1l1 +/+ мишки. Npc1l1 +/+ (плътни пръчки; n = 5), Npc1l1 -/- (отворени пръчки; n = 3) и третирани с езетимиб Npc1l1 +/+ (излюпени решетки; n = 4) на мишки е даден орален манометър от 0,4 mg NBD-холестерол и 1 μCi [14 C] холестерол в зехтин. Кръв се събира след 4 часа чрез сърдечна пункция. Плазмата се екстрахира с хексан и се измерва флуоресценция, за да се определи количествено абсорбцията на NBD-холестерол (А и В). За определяне на радиоактивността (C и D) се отчита 10-μl проба от плазма. Данните представляват средно ± SE на 5 Npc1l1 +/+, 3 Npc1l1 -/- и 4 третирани с езетимиб Npc1l1 +/+ мишки. * P +/+ група.

ДИСКУСИЯ

ПРЕДОСТАВЯ

Тази работа беше подкрепена от Национален здравен институт безвъзмездна помощ RO1 DK-076907.

ОПОВЕСТЯВАНИЯ

Не се декларират конфликти на интереси, финансови или други, от автора (авторите).