Affiliations College of Life Science, Henan Agricultural University, Zhengzhou, China, Държавна ключова лаборатория по биология на растителни болести и вредители от насекоми, Институт за растителна защита, Китайска академия на земеделските науки, Пекин, Китай

калинката

Държавна ключова лаборатория за биология на растителни болести и вредители от насекоми, Институт за растителна защита, Китайска академия на земеделските науки, Пекин, Китай

Държавна ключова лаборатория по биология на растителни болести и вредители от насекоми, Институт за растителна защита, Китайска академия на земеделските науки, Пекин, Китай, Агроскоп, Институт за науките за устойчиво развитие ISS, Цюрих, Швейцария

Affiliation College of Life Science, Henan Agricultural University, Zhengzhou, China

Държавна ключова лаборатория за биология на растителни болести и насекоми-вредители, Институт за растителна защита, Китайска академия на земеделските науки, Пекин, Китай

Държавна ключова лаборатория за биология на растителни болести и вредители от насекоми, Институт за растителна защита, Китайска академия на земеделските науки, Пекин, Китай

  • Сяоджи Джан,
  • Юнхе Ли,
  • Йорг Ромеис,
  • Синмин Ин,
  • Kongming Wu,
  • Юфа Пенг

Фигури

Резюме

Цитат: Zhang X, Li Y, Romeis J, Yin X, Wu K, Peng Y (2014) Използване на поленова диета за излагане на калинката бръмбар Propylea japonica на инсектицидни протеини. PLoS ONE 9 (1): e85395. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0085395

Редактор: Хуан Луис Журат-Фуентес, Университет на Тенеси, Съединени американски щати

Получено: 27 октомври 2013 г .; Прието: 4 декември 2013 г .; Публикувано: 7 януари 2014 г.

Финансиране: Изследването е подкрепено от Националната програма за размножаване на ГМО за нови сортове на КНР (2013ZX08011-001). Финансистите не са играли роля в дизайна на проучването, събирането и анализа на данни, решението за публикуване или подготовката на ръкописа.

Конкуриращи се интереси: Авторите са декларирали, че не съществуват конкуриращи се интереси.

Въведение

Преди търговското отглеждане, нов генетично модифициран сорт растения (GE) трябва да премине строга оценка на риска за околната среда. Важен компонент на тази оценка е оценката на потенциалните неблагоприятни ефекти върху ценните нецелеви организми (NTO), което е особено важно за растенията с ГЕ, които експресират нови инсектицидни гени [1] - [3]. Нецелевата оценка на риска следва многостепенна рамка, която обикновено започва с лабораторни изследвания на токсичността, които се наричат ​​анализи от ниво 1 и се провеждат при контролирани условия на експозиция в най-лошия случай [1], [4], [5]. Целта на тези проучвания е да се идентифицира потенциалната токсичност на инсектицидните протеини, произведени от растенията, устойчиви на насекоми GE (IRGE), върху сурогатни видове, т.е. върху видове, които са представителни за ценни NTO в околната среда, в която се осъществява IRGM да бъдат освободени [1], [4] - [7].

Бръмбарите на калинките (Coleoptera: Coccinellidae) са добре известни хищници на Sternorrhyncha (Hemiptera), като листни въшки, мащабни насекоми, псилиди и бели мухи, но също така плячка и на различни други членестоноги с меко тяло. По този начин те играят важна роля в биологичния контрол на вредителите в множество системи за култури, включително памук, царевица и ориз [8], [9]. Следователно тази група хищници от насекоми е била във фокуса на проучванията за оценка на риска с растения IRGE [10] - [26].

За да се оцени директната токсичност на инсектицидни протеини върху бръмбари на калинки, са разработени тестове за излагане на диета за видовете Coleomegilla maculata, Coccinella septempunctata и Adalia bipunctata, които са лесно достъпни и подходящи за лабораторни изследвания [27]. Сред трите вида C. maculata е особено подходящ като тестов организъм, тъй като може да бъде изложен на високи дози от тестваното съединение, смесено в диета на основата на скариди и яйца [18], [19] или под формата на ГЕ растителен прашец [10]. Въпреки това диетичната система не може да се използва в Китай, тъй като в китайските земеделски екосистеми няма C. maculata.

Propylea japonica (Coleoptera: Coccinellidae) е много разпространен и обилен хищник в цяла Източна Азия в много културни системи, включително царевица, памук, ориз, зеленчуци и овошки [12], [28] - [30]. Както ларвите, така и възрастните от P. japonica са предрасти и се хранят за предпочитане с листни въшки, сачки и белокрилки [31]. Освен това е известно, че те използват растителен прашец като допълнителен източник на храна [32], [33]. Подобно на C. maculata, бръмбарите могат да бъдат директно изложени на растително произведени инсектицидни протеини, когато търсят прашец в култури IRGE. Например, близо 400 ng Cry2Aa на g сухо тегло (DW) са открити при възрастни P. japonica чрез ензимно-свързани имуносорбентни анализи (ELISA), когато са събрани в Bt ориз по време на синтеза, докато при събирането на бръмбари не е открит протеин Cry2Aa в същото поле след антеза [33].

За настоящия доклад разработихме експериментална система за оценка на директните ефекти на инсектицидни съединения върху P. japonica. Впоследствие експерименталната система беше използвана за оценка на ефектите на Cry1Ab, Cry1Ac и Cry1F върху ларвите на P. japonica. Тези протеини се произвеждат от няколко GE култури, включително памук, царевица и ориз.

Резултати

Консумация на прашец на P. japonica

За да установим диета на основата на полен от рапично семе (Brassica napus L.), която може да се използва за осигуряване на високи дози инсектицидни съединения на P. japonica, измерихме дали ларвите лесно приемат прашеца от рапично семе и колко поленови зърна са консумирани. Рапичен семен прашец беше осигурен през първия ден на всяка инсталация, след това беше осигурена смес от цветен прашец и соеви листни въшки, докато се развие в следващия етап.

Средното (± SE) DW на единично полепиено зърно от рапица е оценено на 9,8 ± 0,46 ng. Както се очакваше, потреблението на цветен прашец се увеличи значително с растежа на ларвите на P. japonica (Еднопосочен ANOVA: F = 49.9, P Фигура 1. Консумация на прашец от рапично семе от ларви на Propylea japonica.

Ларвите са били хранени изключително с цветен прашец за един ден и количеството консумиран цветен прашец е показано като тегло на цветен прашец на червата на насекомите (средно + SE). Различните букви над лентите показват значителни разлики (тест на Tukey HSD) (n = 7–10).

Фитнес на P. japonica хранене с прашец от рапично семе

Оценена е годността на полените за поддържане на нормално оцеляване и развитие на P. japonica. Когато се хранят изключително със соеви листни въшки или с комбинация от цветен прашец и листни въшки (както е описано по-горе), над 92% от ларвите на P. japonica достигат стадия на кученцето и над 90% се развиват при възрастни (Таблица 1). Не е установена значителна разлика между тези две лечения за степента на какавидиране и еклозия (χ 2 = 1,06, P = 0,30 и χ 2 = 0,08, P = 0,77, съответно) (Таблица 1) и за 12-дневна степен на преживяемост (χ 2 = 2,75, P = 0,10) (Фиг. 2). По същия начин не е открита значителна разлика за параметъра на прясно тегло за възрастни (FW) (жени: t = 0,93, P = 0,35; мъже: t = 0,65, P = 0,52) (Таблица 1). Въпреки това насекомите, хранещи се с поленова диша/листна въшка, имат значително по-дълго време за развитие на ларвите в сравнение с тези, които се хранят изключително с листни въшки (U = 276,0, P Фигура 2. Оцеляване на ларвите на Propylea japonica при различни диети.

Ларвите са били хранени изключително с листни въшки или цветен прашец или комбинация от двете. Звездичката означава значителна разлика спрямо другите две обработки (n = 75).

Валидиране на диетичната тестова система

За утвърждаване на тестовата система бяха проведени експерименти с използване на протеазен инхибитор Е-64 като тестово съединение. При нелекуваното контролно лечение над 95% от ларвите на P. japonica се развиват при възрастни (Таблица 2). С увеличаване на концентрацията на Е-64 в диетата, степента на преживяемост на P. japonica постоянно намалява (Таблица 2, Фиг. 3). Докато анализът на преживяемостта не разкрива статистическа разлика между лечението, съдържащо E-64 при 75 µg/g диета, и контролата (χ 2 = 1,44, P = 0,23), степента на преживяемост е значително намалена в сравнение с контролата за насекоми, хранени с диети, съдържащи E- 64 при 225 и 450 µg/g диета (и двете P Фигура 3. Оцеляване на ларвите на Propylea japonica при хранене с различни концентрации на E-64.

Ларвите са били хранени с комбинация от прашец от рапично семе, в който е включен E-64 и соеви листни въшки. Звездичка означава значителна разлика между лечението с E-64 и контролата (n = 45).

Токсичност на Cry протеини за ларви от P. japonica

Ефекти върху параметрите на таблицата на живота.

Разработеният тук анализ за хранителна токсичност се използва за оценка на токсичността на Cry1Ab, Cry1Ac и Cry1F за ларви на P. japonica. Сравненията по двойки разкриват, че обработките, съдържащи протеини Cry1Ab, Cry1Ac или Cry1F, не се различават значително от нетретираната (отрицателна) контрола за параметрите на скоростта на какавидиране (Cry1Ab: χ 2 = 0,34, P = 0,56; Cry1Ac: χ 2 = 0,07, P = 0,79; Cry1F: χ2 = 0,33, P = 0,56), скорост на еклозия (Cry1Ab: χ2 = 0,00, P = 0,61; Cry1Ac: χ2 = 0,07, P = 0,50; Cry1F: χ2 = 0,08, P = 0,50) и време за развитие на ларвите (Cry1Ab: U = 546,50, P = 0,13; Cry1Ac: U = 582,50, P = 0,35; Cry1F: U = 656,50, P = 0,62) (Таблица 3). По същия начин не се открива значителна разлика между всеки от Cry протеините и лечението с отрицателна контрола за FW при жени и мъже (тест на Dunnett; всички P> 0,1). За разлика от тях, насекомите, хранени с E-64, са имали значително намалено какавидиране (х 2 = 7,47, Р = 0,01) и скорост на еклозия (х 2 = 30,18, Р 0,05 и за двата пола). Кривите на преживяемост са били значително повлияни от диетата (χ 2 = 43,32, df = 4, P 0,50), докато преживяемостта на P. japonica е била значително по-ниска при лечението с E-64 (χ 2 = 11,1, P = 0,001) (фиг. 4 ).

Ларвите се хранят с комбинация от прашец от рапично семе, в който са включени инсектицидните протеини и соеви листни въшки. Звездичка означава значителна разлика между инсектициден протеин и контролата (n = 45).

Поглъщане на плач протеини от P. japonica.

Според нашите измервания чрез имуносорбентни анализи с двойно антитела, свързани с ензими (DAS-ELISA), всички ларви на P. japonica съдържат Cry1Ab, Cry1Ac или Cry1F протеин в Bt обработките, но никой не съдържа Cry протеин в контролата. Средните (± SE) концентрации на Cry1Ab, Cry1Ac и Cry1F, открити в ларвите на 4-та възраст на P. japonica, са съответно 9,67 ± 7,10, 10,79 ± 5,02 и 11,17 ± 3,28 µg/g DW на насекомите. Не е открит Cry протеин в какавидите P. japonica.

Стабилност и биоактивност на протеините на плача.

Степента на откриване на ELISA за трите протеина Cry след смесване в прашеца от рапично семе е приблизително 56–83% от номиналните концентрации; откритите средни (± SE) концентрации (µg/g FW на полени) са 417,4 ± 26,8 за Cry1Ab, 402,2 ± 10,4 за Cry1Ac и 278,5 ± 19,1 за Cry1F (n = 5). След двудневния период на хранене средната концентрация на протеин Cry в диетата е намаляла с 5,7 до 23,6%. Този спад е значителен за Cry1F (212,7 ± 8,7 µg/g; t-тест на Student; t = 3,14, df = 4, P = 0,04), но не и за Cry1Ac (379,2 ± 19,9 µg/g; t = 1,02, df = 4, P = 0,37) и Cry1Ab (447,9 ± 33,8 µg/g; t = 0,66, df = 3, P = 0,56).

Биоанализите на чувствителни насекоми показват, че средното тегло (± SE) на ларвите на C. suppressalis е 1,97 ± 0,15 mg при хранене с изкуствена диета, включена с екстракта от цветен прашец, който не е бил третиран с Cry протеин (контрол) в продължение на 7 дни, което е значително по-голямо от тези, хранени с каквато и да е диета, съдържаща Cry протеин (всички P Фигура 5. Чувствителен биоанализ на насекоми с прашец от рапично семе.

Тегло (средно + SE) на ларвите на Chilo suppressalis, хранени с изкуствени диети, включени с екстракти или от нетретиран прашец на рапично семе (контрол), или полен, съдържащ Cry1Ab, Cry1Ac или Cry1F, които са били прясно приготвени или са били изложени на ларви на Propylea japonica за 2 дни (n = 30).

Дискусия

Установихме използването на прашец от рапично семе за излагане на P. japonica на високи дози инсектицидни съединения при лабораторни анализи за токсичност. Прашецът от рапично семе е бил лесно приет и използван от P. japonica. С остаряването на ларвите на P. japonica, консумацията на цветен прашец непрекъснато се увеличава и на четвъртия етап една ларва съдържа средно над 15 000 поленови зърна (еквивалентни на около 150 µg DW). Резултатите от нашата биологична проба за фитнес показват, че режимът на хранене, при който ларвите са били хранени с цветен прашец само за първия ден от всеки стадий на ларвите и впоследствие са получавали листни въшки в допълнение към полените, осигурява изключително подходяща диета. Повече от 90% от ларвите са оцелели до стадий на възрастни и теглото на възрастен е подобно на тези, хранени изключително със соеви листни въшки, която е предпочитаната естествена плячка. Интересното е, че плодовитостта на P. japonica се е увеличила с повече от 40% при хранене с диетата с поленови въшки в сравнение с жените, които са получили само плячка от листни въшки. Въпреки че беше установено, че развитието на ларвите на P. japonica се забавя значително, когато се храни с диета на основата на полени, това не може непременно да повлияе на пригодността на диетата, използвана в анализа на токсичността на храната.

Експериментите за хранене с протеазен инхибитор Е-64 показват, че докладваният анализ на експозицията на диети може ефективно да открие токсичните ефекти на тестваното съединение. Наблюдавани са дозозависими отговори за важни параметри на таблицата на живота, включително степен на преживяемост, честота на какавидиране, степен на еклозия, време за развитие на ларвите и тегло на възрастен. Тестовата система, разработена в настоящото проучване, е в състояние да открие диетичните ефекти на инсектицидното съединение и е установено, че преживяемостта на ларвите и времето за развитие на ларвите са най-чувствителният индикатор за токсичност.

Използвайки тази тестова система, ние оценихме потенциалната токсичност на пречистени Cry1Ab, Cry1Ac и Cry1F за ларви на P. japonica. Тези Cry протеини са широко използвани в трансгенни сортове от различни култури, включително памук, царевица и ориз [34]. Нашите резултати не разкриват вредно въздействие на тестваните Cry протеини върху нито един от измерените параметри на жизнената маса на P. japonica. Храненето с диети, съдържащи E-64, за разлика от тях, значително намалява оцеляването и развитието на ларвите на P. japonica. Този положителен контрол демонстрира, че тестваните съединения всъщност са били погълнати и че нашата експериментална система е успяла да открие неблагоприятните ефекти, причинени от токсичните съединения в храната.

В обобщение, резултатите от нашето проучване са в съответствие с лабораторните проучвания, които съобщават за липса на директни токсични ефекти на протеини Cry1 върху бръмбари калинки, както и с резултатите от много полеви проучвания, проведени с Bt царевица или памук, които не предоставят доказателства за пряко неблагоприятно въздействие върху бръмбарите на калинки и други естествени врагове [52], [53]. Изследването осигурява здрава диетична експозиционна система, която може да се използва за изследване на директните токсични ефекти на перорално активни инсектицидни съединения върху летални и сублетални крайни точки на ларви на бръмбар калинка P. japonica.

Материали и методи

Декларация за етика

Не са необходими конкретни разрешителни за описаните полеви проучвания. Оризовите полета, от които P. japonica, използвани в това проучване, първоначално са били събрани, са собственост на института на автора (Институт за растителна защита, Китайска академия на земеделските науки, CAAS). Тези полеви проучвания не включват застрашени или защитени видове.

Експериментални условия

Отглеждат се насекоми и се провеждат експерименти в климатични камери при 26 ± 1 ° C, 75 ± 5% относителна влажност и 16∶8 часа светлина: тъмен цикъл.

Насекоми

Образци от P. japonica бяха събрани в експерименталната полева станция на Института по растителна защита, CAAS, близо до град Лангфанг, провинция Хъбей, Китай (39,5 ° северна ширина, 116,7 ° изток) през 2012 г. Колония впоследствие беше поддържана в лабораторията без въвеждане на полево събрани насекоми за над 4 поколения. Както ларвите, така и възрастните от P. japonica са отгледани на разсад от соя, заразени с глицини Aphis (Homoptera: Aphididae). Новоизлюпени (2-тест и U-тест на Ман-Уитни. За тези статистически тестове беше приложена корекцията на Bonferroni, за да се коригират многократни сравнения по двойки. Ефектът от диетичните лечения върху оцеляването на P. japonica беше анализиран с процедурата на Kaplan-Meier и тест на Logrank.

В допълнение, t-тестовете на Student са използвани за сравняване на концентрациите на Cry протеин в пресен прашец спрямо прашец, изложен на ларви на P. japonica в продължение на 2 дни, и са извършени еднопосочни ANOVA, последвани от Tukey HSD тестове за сравняване на 7-d тегло на ларвите на C. suppressalis, хранено с изкуствени диети, съдържащи екстракти от чист пресен прашец или екстракти от полени, съдържащи Cry протеини.

Всички по-горе статистически анализи бяха проведени с помощта на софтуерния пакет SPSS (версия 13 за windows, 2004).

Благодарности

Благодарим на д-р Елизабет Грабау (Технически университет във Вирджиния) за нейните критични коментари по по-ранен проект на ръкописа.

Принос на автора

Замисля и проектира експериментите: YL XZ. Извършва експериментите: XZ. Анализирани данни: YL XZ JR. Реактиви/материали/инструменти за анализ, допринесени: YP XY. Написа хартията: YL JR XY KW YP.