Субекти

Резюме

Въведение

Материали и методи

Декларация за етика

Цялата работа с животни, описана в това проучване, е одобрена от Институционалния комитет за грижи и употреба на животните (IACUC) към Университета в Арканзас и всички експерименти са извършени в съответствие с одобрените насоки и разпоредби.

Дизайн на експерименти с животни

Вземане на кръв и извличане на ДНК

Кръвни проби бяха събрани от 5 привидно здрави птици на кошара на 14, 41 и 49-годишна възраст за анализ на микробиота, давайки 240 кръвни проби (5 птици на писалка × 16 писалки на възраст за вземане на проби × 3 възрасти за вземане на проби). Допълнителни 12 кръвни проби бяха събрани от птици, които се поддават на BCO (n = 12; 5 и 7 проби от 41 и 49-дневна възраст, съответно), което прави общо 252 проби, които трябва да бъдат анализирани за профилиране на 16S рРНК. Кръвни проби бяха събрани асептично от вена на крилото с помощта на EDTA Vacutainers. Един ml кръвна проба се центрофугира (5000 rpm в продължение на 5 минути при стайна температура) с помощта на микроцентрифуга и 200 μl buffy слой се събира в стерилната ламинарна камера и се съхранява при -20 ° C. Геномна ДНК беше извлечена от слоестите слоеве, използвайки BiOstic® Bacteremia DNA Isolation Kit (MoBio), следвайки инструкциите на производителя. ДНК пробите се анализират с помощта на Qubit 2.0 Fluorometer (Life Technologies) за количество и чистота и се съхраняват при -20 ° C.

PCR протокол за 16S rRNA генна амплификация

изследване

Схематична стратегия за 16S rRNA секвениране.

(а) Блок-схема, представяща подготовката на библиотеката, форматирането чете приемливи за QIIME анализ, които бяха допълнително анализирани с помощта на LefSe и PICRUSt. * За анализ PICRUST е използвана нормализирана таблица на OTU. (FP = преден праймер, RP = обратен праймер, V = променлива област на 16s РНК ген, P5 и P7 = праймери за секвениране Illumina, N = случаен нуклеотид, BC-F = баркод на праймер, BC-R = баркод на обратен праймер и LS = свързваща последователност). (б) Стълбовидна диаграма, показваща четене на разпределение на 252 проби преди (червено) и след нормализиране (синьо) на OTU таблицата. (° С) Стълбовидна диаграма, показваща средния брой четения на проба със стандартна грешка преди (червено) и след нормализиране (синьо).

Анализ на данни

Блок-схемата, която очертава анализа на 16S рРНК последователността, е показана на фиг. 1а. Четенията на сдвоени краища напред и обратно от последователността на Illumina бяха събрани с помощта на Quantitative Insights into Microbial Ecology, QIIME 1.9.1 25, чрез join_paired_ends.py скрипт, използвайки метода fastq-join. След това последователностите от баркод на четене напред (BC-F) и обратно четене (BC-R) бяха обединени и обединени (5 ′ край) със сглобената последователност (3 ′ край) след отхвърляне на 8 нуклеотидни случайни последователности и 27F и 533R последователности от праймери с помощта на персонализиран Perl скрипт, който създаде fastq файл, съвместим с анализа надолу по веригата, използвайки QIIME.

Четенията бяха групирани с помощта на UCLUST 26 и избирането на оперативни таксономични единици (OTU) със затворена референтна опция беше извършено с помощта на изданието на базата данни 13_8 GreenGenes. Таблицата на OTU BIOM (матрица за биологично наблюдение) беше нормализирана с QIIME (normalize_table.py), използвайки метода на кумулативно мащабиране на сумата (CSS), който след това беше използван за таксономични назначения, оценка на алфа разнообразието, идентификация на биомаркер и прогнозиране на функционалното съдържание на метагенома. Индексите на алфа разнообразието бяха сравнени с помощта на еднопосочен анализ на вариацията (ANOVA) и post hoc анализът е направен с метода на Tukey-Kramer HSD. Анализът на приликите (ANOSIM) между групите метаданни беше извършен, като се използва непретеглена метрика за разстояние UniFrac с QIIME (compare_categories.py). В допълнение, основните координатни анализи (PCoA) за оценки на бета разнообразието бяха извършени с QIIME (24), използвайки претеглени и непретеглени UniFrac метрики при различна равномерна дълбочина на вземане на проби.

Идентифицирането на биомаркера беше извършено с помощта на размер на ефекта на линейния дискриминант на анализа (LEfSe) 27. Функционалното съдържание на метагенома на микробиотата от пилешка кръв беше предсказано с PICRUSt (Филогенетично изследване на общностите чрез реконструкция на ненаблюдавани състояния), използвайки 16S rRNA генни последователности 28. Бактериалната мрежа е визуализирана с помощта на Cytoscape 3.2.1 29 .

Резултати

Демултиплексирането и качественото филтриране на QIIME са произвели 4 153 965 сглобени последователности за четене, вариращи от 40 до 580 bp със средна дължина 469 bp, което показва наличието на химерни последователности поради отклонено PCR усилване или неправилно сглобяване. В това проучване използвахме метода за бране на референтни OTU, тъй като изследваме нов тип микробиоми, за които структурата на общността, разнообразието и членството са до голяма степен неизвестни. Въпреки това, ние също сравнихме резултатите, получени чрез метод на затворена референция, с тези както от отворени референтни, така и от нови методи за бране на OTU (допълнителна таблица 2). Въпреки че отвореният референтен метод и методът за ново избиране на OTU произвеждат по-голям брой OTU (съответно на ср. 196 и 218), както и по-големи четения на проба, има значително по-големи части от отчитанията (съответно на ср. 72,5 и 79,3%) ), които не са били присвоени на нито една таксономична група в текущата база данни 13_8 GreenGenes. В допълнение, за да премахнем ефективно всички шумови или химерни последователности в анализа надолу по веригата, ние предпочетохме затваряне на затворена референтна OTU пред другите два метода.

Затворената референтна таблица на OTU имаше средна дълбочина на пробата от 1621 отчитания на проба (± 139,07), както е показано на фиг. 1б. OTU таблицата беше нормализирана с помощта на кумулативно мащабиране на сумата (CSS) с QIIME (Фиг. 1b, c). Въпреки че средните показания на пробите бяха намалени чрез нормализиране повече от 6 пъти (266,55 на проба), това също намали стандартната грешка (± 7,01). CSS нормализираната OTU таблица беше използвана за присвояване на таксономия, оценки на алфа разнообразие, LEfSe и PICRUt анализ. Анализът на бета разнообразието беше извършен при различна дълбочина на вземане на проби при четене и ANOSIM с 999 пермутации, използвайки непретеглена метрика UniFrac при равномерна дълбочина на вземане на проби от 400 четения на проба.

Присвояване на таксономия

Разпределение на таксоните на различно ниво.

Алфа разнообразие

Алфа разнообразието е измерването на многообразието в рамките на общността и има различни показатели, които са създадени за измерване на алфа разнообразието с акцент върху различни аспекти на структурата на общността. Като цяло микробиотата на пилешката кръв е имала средно 37,21 (± 1,13) OTU (min = 9; max = 107) при 97% сходство на последователността (фиг. 3; допълнителна таблица 3). Наблюдаван е значителен контраст в алфа разнообразието на BCO спрямо здравото пиле с PD цяло дърво индекс (t-тест, р 0,05). Освен това, пилетата на фуражи за начало спрямо фуражи показват значителна разлика в алфа разнообразието (t-тест, р 0,05) (фиг. 3), което е в съответствие с предишното ни проучване 4 .

Индекс на алфа разнообразие на таблица за нормализирана микробиота в кръвта на CSS.

Бета разнообразие

Анализ на приликите (ANOSIM), базиран на непретеглена метрика UniFrac, показва, че BCO спрямо здрави пилета (R = 0,4402, p = 0,001) показват значителна разлика в структурата на бактериалната общност. Въпреки това, бактериалните съобщества не се различават значително между групите според други критерии, включително фураж, под и настройка на писалка (Таблица 1). Стойността R, равна на 1, показва, че пробите са напълно различни, докато 0 означава, че те са идентични. Важно е да се отбележи, че има значителна разлика в алфа разнообразието между BCO спрямо здравите птици (с индекс на цялото дърво на PD), а също и между различните възрастови групи (фиг. 3). Графикът на главния координатен анализ (PCoA), базиран на претегленото разстояние на Unifrac, показва отчетливата обща разлика между BCO спрямо здравите пилета в структурата на общността (фиг. 4а). Бактериалните съобщества на ден 41 също се различават значително от тези на ден 14 и 49 (фиг. 4б). Това е в съгласие с предишното ни наблюдение, че индексите на алфа разнообразието на общностите на ден 41 са били значително по-високи в сравнение с ден 14 и 49. В допълнение, PCoA парцелът показва различни бактериални съобщества между пилетата, хранени със стартер и финишър фураж (Фиг. . 4в), въпреки че ANOSIM не е успял да улови тази значима характеристика (Таблица 1).

Основен координатен анализ (PCoA) парцел от микробиоми в кръвта на пилета.

(а) PCoA графика на здрави (n = 171) срещу BCO (n = 9) пилета, използващи претеглена метрика UniFrac при равномерна дълбочина на вземане на проби от 400 прочетени за проба. (б) PCoA графика от 14-дневни (n = 30), 41-дневни (n = 41) срещу 49-дневни (n = 36) стари пилета с претеглена UniFrac метрика при равномерна дълбочина на вземане на проби от 1000 четения на проба. (° С) PCoA графика на стартер (n = 67) срещу финишър (n = 154) пилета, хранени с диета, използващи непретеглена метрика UniFrac при равномерна дълбочина на вземане на проби от 200 прочетени за проба.

Значителна разлика в бактериалните съобщества на здрави пилета срещу BCO също се илюстрира чрез йерархично групиране. BCO пилетата на 49-дневни пилета бяха групирани отлично от здравите пилета. Въпреки това, 41-дневните BCO пилета не показват никакъв модел на отличително групиране (Фиг. 5а). Мрежовият анализ между пилета (252 проби) и OTU (бактериални видове) показва известна степен на разграничение в моделите на взаимодействие между BCO и здрави пилета (фиг. 5б), което предполага различни бактериални съобщества.

Групиране на пилета въз основа на микробиота в кръвта.

(а) Йерархично групиране на здрави пилета срещу BCO на базата на микробиота в кръвта. Филогенетичното дърво е генерирано с помощта на софтуера FigTree V1.3.1 с претеглена метрика UniFrac, използвайки данните преди нормализиране. Зелените и червените линии представляват BCO пилета съответно на пилета на 41 и 49 дни. Черните линии са здрави пилета. Числото в края на реда показва идентификатора на пилешка проба. (б) Бактериална мрежа от микробиота от пилешка кръв, произведена с помощта на софтуера Cytoscape V3.2.1. Червените, сините и белите възли представляват съответно BCO пилета, здрави пилета и OTU. Зеленият ръб е мрежата от BCO пилета, а оранжевият ръб е този на здравите пилета.

Забелязахме, че всички BCO птици са само от двете възрастови групи (ден 41 и 49) и две групи, създадени за писалки (W35-56 и W1-56). Поради това извършихме допълнителен анализ на бета разнообразието, като използвахме подгрупа от 77 проби, които принадлежат към тези възрастови групи и групи, създадени за писалки, включително 65 здрави птици и 12 BCO птици. ANOSIM анализ, базиран на претеглена метрика UniFrac, показва по-голямо разделяне между BCO и здрави пилета (R = 0,5293, p = 0,001) в сравнение с това с целия набор от данни (n = 252). Графиката PCoA, показана на фиг. 6, също подкрепя резултата от ANOSIM анализа.

Основен координатен анализ (PCoA) парцел от микробиоми в кръвта на избрана подгрупа пилета.

PCoA графика на здрави (n = 51) срещу BCO (n = 9) пилета, използващи претеглена метрика UniFrac при равномерна дълбочина на вземане на проби от 400 прочетени за проба.

Биомаркери на BCO

Таксономичните групи, които са диференциално разпространени между здрави пилета срещу BCO, бяха идентифицирани с помощта на размер на ефекта на линейния дискриминант на анализа (LEfSe) с α = 0,05, LDA резултат от най-малко 2 и относително изобилие над 0,1. Общо 26 характеристики имат значително различно изобилие между здрави и BCO пилета. На ниво род, микробиотата в кръвта на BCO пилетата е обогатена диференциално с родове Стафилококи, Granulicatella и Микробактерии, като има предвид, че здравите пилета са обогатени с Псевдомонада, Enhydrobacter и Aquabacterium (Фиг. 7б). Също така забелязахме, че видът Фиксира е обогатен с пилета BCO. по същия начин, Алфапротеобактерии беше силно обогатен с BCO пилета, докато Бетапротеобактерии и Гамапротеобактерии при здрави пилета на ниво клас (фиг. 7б).

Диференциално изобилни таксони, идентифицирани с помощта на LEfSe анализ, използвайки кръвна микробиота на пилета с относително изобилие ≥ 0,1.

(а) Таксономична кладограма, получена от анализ на LEfSe. Червено и зелено показват таксони, обогатени съответно с BCO и здрави пилета. Яркостта е пропорционална на изобилието от таксон. (б) Обогатените такси с BCO пилета са показани в червено с отрицателен LDA резултат и здрави пилета в зелено с положителен LDA резултат (> 3,5 и в двата случая). Таксон между две долни черти е предложеното име на базата данни GreenGene.

Прогнозиран функционален генетичен капацитет на микробиомите от пилешка кръв

Предвиден функционален състав на микробиота от пилешка кръв с помощта на PICRUSt.

(а) Относително изобилие от категории KEGG COG на ниво 1 в микробиоми от пилешка кръв. (б) Относително изобилие (≥0,5) от пътя на KEGG на ниво 3 категории функционални пътища, генерирани с помощта на JMP софтуер. (° С) Диференциално богати характеристики (KEGG COG категории, относително изобилие ≥0,5), получени с използване на LEfSe с LDA резултат ≥2,8.

Дискусия

Това е първото изчерпателно проучване, анализиращо бактериални микробиоми, които съществуват в кръвта на гръбначни животни, които не са хора. През последните години нараства интересът да се характеризират микробиотите, свързани с различни тъкани на тялото при различни здравословни условия. Някога се смяташе, че частите на тялото са стерилни, като кръв 30, стомах 31, пикочен мехур 32, бели дробове 33, кости, стави 4 и гърди 34 имат своята местна микробиота. Дисбиозата на тъканната микробиота е свързана с различни заболявания, включително сърдечно-съдови заболявания 10, диабет 35, безалкохолна мастна чернодробна болест (NASHD) 36, възпалително заболяване на червата (IBD) 37, псориазис 38, затлъстяване 39, астма 39 в детска възраст, функционална чревна болест 40 и колоректален карцином 41. Тук изследвахме микробиотата в кръвта на пилета с цел идентифициране на потенциални бактериални биомаркери, свързани с BCO.

Резултатът от анализа на данните в това проучване показва съществуването на бактериални съобщества, които се състоят от 30 до 40 OTU в кръвта на пилета-бройлери, независимо от възрастта и други условия на околната среда или гостоприемника. Анализът на бета разнообразието (фиг. 4а и 6), йерархичният клъстериращ анализ (фиг. 5а) и анализът на бактериалната мрежа (фиг. 5б), базиран на микробиотата в кръвта и йерархичното групиране, базиран на прогнозирания метагеном на микробиотата в кръвта (фиг. 8б), предполага, че бактериалните съобщества в кръвта на BCO птиците се отличават от тези при здравите птици, което предполага наличието на определени селективни налягания, допринасящи за изместването на кръвните микробиоми при BCO птици. Обаче само цялото дърво на PD показва значителна разлика в алфа разнообразието между BCO и здравите птици, което е в съгласие с филогенетично отдалечената кръвна микробиота при BCO птици, както е показано в анализа на бета разнообразието (Фигури 4а и 6).

В нашето непубликувано придружаващо проучване, кръвните проби от същото стадо са директно поставени върху богати агарови среди. Резултатът показва, че броят на колониите на 49-ия ден е бил постоянно по-висок на телените подове (L35W и W56) в сравнение с постелята (L56), което показва, че стресът върху теления под е насърчил бактериемия, вероятно чрез бактериална транслокация през чревния епител. Освен това броят на колониите на 49-ия ден също е бил постоянно по-висок при куците птици в сравнение със здравите птици. Тези резултати показват силна корелация между напрежението от настилки от тел, тежестта на бактериемията и куцотата на BCO.

Едно практическо приложение на това проучване е да се идентифицират бактериални биомаркери, които могат да се използват за идентифициране на отделните пилета-бройлери в по-ранни възрасти, които са склонни към развитие на BCO в по-късни епохи. Анализът на данните в това проучване наистина идентифицира таксономични групи на различни нива, които са значително обогатени с BCO птици в сравнение със здрави птици. Интересното е, че родът Стафилококи е една от 18-те характеристики (включително 3 рода), значително обогатени в проби от BCO, което подчертава значението на този род, който често е изолиран от лезии на BCO 3,4,5. Наскоро Ал-Рубайе и др. 44 съобщи, че предизвикателството на бройлери с С. agnetis, която беше най-често изолирана Стафилокозни видове от BCO легиони в тяхното проучване, значително увеличиха куцотата от 10 (Контрол) на 40%, докато предизвикателството с друг изолат Enterococcus faecalis намалява честотата на куцота. Това може да означава потенциалното значение на С. agnetis като причинител на BCO патогенезата при пилета-бройлери, въпреки че данните за профилиране на гена ни за 16S рРНК не успяват да предоставят значима информация за Стафилококи видове поради ограничената резолюция на таксономичното разпределение.

В това проучване обаче BCO е открит само при птици на възраст 41 и 49 дни и по този начин бактериалните биомаркери имат ограничена стойност за ранна диагностика на предразположени към BCO птици. Този аспект трябва да бъде разгледан внимателно в експерименталния дизайн на бъдещите проучвания, за да се позволи идентифициране на потенциални бактериални биомаркери в кръвни проби на млади птици, които предсказват развитието на BCO в по-възрастни възрасти.

Анализираните в това проучване кръвни микробиоми имат значително въздействие върху здравния статус на пилетата-бройлери, включително BCO патогенезата, както е показано в това проучване, както и други заболявания или стресови състояния на пилета-бройлери.

Допълнителна информация

Как да цитирам тази статия: Mandal, R. K. и др. Разследване на микробиота в кръвта и нейната потенциална връзка с бактериална хондронекроза с остеомиелит (BCO) при бройлери. Sci. Представител. 6, 25882; doi: 10.1038/srep25882 (2016).