Субекти

Резюме

Това проучване представя приложението на метаболомиката за оценка на промените в метаболитите на рубца при месодайните говеда, хранени с три различни вида диети: богата на фураж, смесена и богата на концентрат. Пробите от румен флуид бяха анализирани чрез 1 H-NMR спектроскопия и получените спектри бяха използвани за характеризиране и сравняване на метаболомичните профили между типовете диети и оценка на потенциала на NMR метаболитните сигнали да бъдат използвани като прокси на емисиите на метан (CH4 в g/kg DMI) . Наличните данни се състоят от 128 измервания, взети от 4 експеримента с измервания на CH4, направени в дихателните камери. Прогнозното моделиране на CH4 беше проведено чрез регресия с частични най-малки квадрати (PLS), като се монтираха калибрационни модели, използващи метаболитни сигнали само като предиктори, или използващи метаболитни сигнали, както и други диетични и животински ковариати (DMI, ME, тегло, BW 0,75, DMI/BW 0,75). Кръстосано валидираните R2 са съответно 0,57 и 0,70 за двата модела. Говедата, предлагани с богата на концентрат диета, показват повишаване на аланин, валерат, пропионат, глюкоза, тирозин, пролин и изолевцин. По-ниският добив на метан е свързан с богатата на концентрати диета (стр

Въведение

Животновъдството има най-голям антропогенен принос за глобалния бюджет на CH4 (103 [95–109] Tg CH4 годишно −1 през 2000–2009 г.) 1, като ентеричните емисии на CH4 допринасят най-много за това (87–97 Tg CH4 годишно -1 през 2000–2009) 1,2,3. Метанът е мощен парников газ (GHG) с потенциал за глобално затопляне (GWP) 28 пъти по-висок от въглеродния диоксид (CO2), с 12-годишен атмосферен живот 4 и допринася значително за стратосферното изчерпване на озона 5. Производството на метан също е свързано с нетна загуба на енергия за животното, варираща от 2–12% от енергийния прием 6. Производството на метан е свързано главно с ферментация на фураж и се среща предимно в търбуха, а останалите (11% в едно проучване) се срещат в долната част на задните черва .

Румен метаногените основно използват H2 и CO2 за производството на CH4 по хидрогенотрофния път. Производството на ацетат и бутират води до повече H2, които се произвеждат и се предлагат за производство на CH4, докато пропионатът води до по-малко, тъй като производството на пропионат изразходва H2, оставяйки по-малко на разположение за производството на CH4 8,9. Доскоро се смяташе, че това е единственият път за производство на CH4. Друга група метаногени обаче използва метил-съдържащи метаболити като метанол и метиламин, за да произвежда СН4, използвайки метилотрофния метаногенен път 10. Този път се намира в Термоплазмати род археи, показващ засилен растеж, когато се дават добавки с метиламин. Приносът на тези субстрати към производството на CH4 все още не е оценен, въпреки че е известно, че тези археи могат да бъдат стимулирани чрез увеличаване на диетичните концентрации на пектин, както и повишено съдържание на зърно в храната 8,11 .

Компонентите на диетата за преживни животни, особено въглехидратния тип, оказват силно влияние върху тези пътища, като променят микробиотата на червея. Много експерименти показват диетични ефекти върху производството на CH4 при преживните животни 12. Тези проучвания подчертават няколко важни фактора като качество на фуража и съотношение фураж към концентрат, влияещи върху емисиите. Като цяло, по-висок дял на фураж в диетите води до увеличени емисии на CH4. Съществува обаче постоянно изискване за оценка на ефектите от различни диети и добавки върху емисиите на CH4.

Целите на тази работа бяха да се идентифицират ЯМР сигнали и свързаните с тях метаболити, свързани с различните диети, с особен интерес към метаболитите, принадлежащи към метилотрофния път, по-специално метанол и метиламин, и да се оцени възможността за използването на тези сигнали като прокси за емисии на CH4 преживни животни.

Материали и методи

Всеки от отделните експерименти в това проучване е одобрен от Комитета за експерименти с животни в Шотландския селски колеж (SRUC), който действа като местна група за етичен преглед, изискван съгласно Закона за животните в Обединеното кралство (научни процедури) от 1986 г. Проучванията са проведени в SRUC Beef and Изследователски център за овце в Единбург и цялата работа е предприета в съответствие с изискванията на Закона за животните в Обединеното кралство (Научни процедури) от 1986 г.

Животни и диети

Четири от тези проучвания са публикувани преди това, където 17,18,19,20 могат да бъдат намерени пълни подробности за методологията .

Вземане на проби от румен

Тъй като вземането на проби от течност от рубци не може да бъде направено, докато говедата са били в камерите, пробите са взети от животното малко след като е напуснало камерата (в рамките на 2 часа време). Назогастрална сонда (16 × 2700 mm Equivet Stomach Tube, Jørgen Kruuse A/S) се вкарва през носната кухина и се получават приблизително 50 ml проба от търбух и се филтрира през 2 слоя муселин. Първата част от пробите се изхвърля, ако има доказателства за замърсяване със слюнка или кръв. Пробите незабавно бяха замразени при -20 ° C до по-нататъшен анализ.

Подготовка на проби и събиране на ЯМР данни

Бяха придобити три експеримента с TOCSY (обща корелационна спектроскопия), използвайки DIPSI-2 и времената на смесване съответно от 20, 40 и 60 ms. За потискане на водата бяха използвани импулси от 2 ms. 2D 1 H, 13 C HSQC (хетероядрена единична квантова корелация) -TOCSY използва 25 ms DIPSI спин-заключване. 2D 1 H, 13 C HMBC използва потискане на две състояния на корелации с една връзка, зададени за 1 JСН = 125 и 160 Hz и интервал за еволюция на дълги разстояния, оптимизиран за n JСН = 8 Hz.

Статистически анализ

Анализ на изследователските данни

Разпределението на NMR сигналните интеграли беше графично представено и сравнено с използване на паралелни плотове. Впоследствие данните бяха обработени чрез анализ на основните компоненти (PCA), за да се улесни идентифицирането на моделите и интерпретацията. Натоварванията и резултатите от PCA бяха използвани за показване на набора от данни на равнинен биплот въз основа на първите два основни компонента (които съставляваха 95% от общата променливост), като точки, представящи пробите и стрелките от началото, посочваха посоките на увеличаване на ЯМР сигнални интеграли.

Сравнения между концентрат и смесена диета

Първо, производството на CH4 (CH4 g/kg DMI, изразено в естествен логаритъмен мащаб) се сравнява между концентрат и смесен тип диета, използвайки линеен смесен модел (LMM), оборудван с ограничена максимална вероятност (REML). Този анализ се основава на данни от проучвания 1 и 4 (таблица 1), за които информацията от тези два вида диети е сравнима, тъй като те използват една и съща методология. Моделът включва тип диета като фиксиран ефект и номер на изследването като случаен ефект, за да се отчете променливостта между пробите от двете проучвания.

Освен това е използван пермутационен дисперсионен мултивариантен анализ (PERMANOVA) 21 за сравняване на целия ЯМР спектрален профил между концентрат и смесен тип диета.

Прогнозно моделиране

Всички анализи на данни и моделиране, описани по-горе, бяха проведени в R системата за статистически изчисления v3.5 25. Статистическата значимост се оценява при обичайното ниво на значимост от 5%.

Резултати

Първоначален анализ на ЯМР спектрите

Във всички проби доминират сигнали, свързани с обикновени соли на летливи мастни киселини (VFA) - ацетат, пропионат и бутират. Допълнителни незначителни сигнали в алкиловите, О-алкиловите, въглехидратните и ароматните области на спектрите също присъстват. Редица съответни незначителни метаболити са идентифицирани чрез интерпретация на 2D TOCSY, 2D 1 H, 13 C HSQC, 2D 1 H, 13 C HSQC-TOCSY и 2D 1 H, 13 C HMBC спектри на представителна проба и сравнение с литературни данни 15, 16. Използването на 1 H-13 C корелирани експерименти в този анализ беше необходимо, тъй като много 1 H резонанси се припокриват при 600 MHz и тяхната идентичност в 1D 1 H NMR спектрите е закрита (идентифицираните метаболити заедно с техните 1 H и 13 C химични отмествания са обобщено в допълнителна таблица 1S). Присвояването на метаболитни резонанси също беше подпомогнато от анализа на 1D sTOCSY спектрите 15, базирани на 128 екстракта от екстракти от рубец. В 1D sTOCSY спектрите се избира един пик на „драйвер“ по това време и R 2 стойностите се изчисляват в целия спектър и се визуализират от цвета на пиковете. Докато, както се очаква, най-силните корелации се наблюдават между протоните на едно и също съединение, корелациите между метаболитите също са очевидни.

Започвайки с VFA, цветно кодираните средни ЯМР спектри (допълнителни фигури 1S-3S) подчертават вътрешно- и, което е важно, междумолекулните корелации между метаболитите, показващи подобни концентрационни тенденции. Проверката на тези спектри показа, че (i) ацетатът и бутиратът са силно корелирани, (ii) пропионатът корелира по-силно с ацетат, отколкото с бутират, и (iii) като цяло, корелациите на VFA с други незначителни метаболити се увеличават в ред на бутирата Фигура 1

ядрено-магнитен

Разпределение на интегрални ЯМР сигнали на рубца. Осветена средна секция (между пунктирани линии), съответстваща на сигнали, които, заедно с VFA, показват връзка с добива на метан. Данни, обобщаващи 128 метаболита във всички 211 проби.

Наборът от данни беше ефективно представен от PCA биплот, базиран на първите два основни компонента (фиг. 2), който представляваше около 95% от общата променливост на данните (76% обяснено с първия основен компонент, PC1, и 19% обяснени от втория основен компонент, PC2). Според конфигурацията на биплот лъчите, стойностите в PC1 представляват най-вече вариация в ацетат, с точки вдясно от началото, свързани с нива над средните за всички VFA. Стойностите в PC2 се определят предимно от съдържанието на пропионат, като по същество се отделят пробите според сравнението между пропионат и бутират.

PCA биплот на 1 Н ЯМР спектрални данни за румен. Проби (точки), отличаващи се от типа диета и основните VFA сигнали (стрелки), обозначени. Първият основен компонент (PC1) е свързан предимно с преобладаване на ацетат заедно с бутират, а вторият основен компонент (PC2) е свързан предимно с преобладаване на пропионат.

Поради ниските нива на останалите сигнали, те бяха представени от доста къси вектори в скалата на биплота и едва ли бяха различими (само основните VFA бяха обозначени, за да улеснят визуализацията). Пробите (точките) бяха разграничени по символи и цветове според трите основни типа диети (концентрат, смесен и фураж). Ъгълът между биплот лъчите е пропорционален на корелацията между съответните сигнали. По този начин видовете ацетат и бутират са по-тясно свързани и най-вече свързани със смесени и фуражни диети, докато пропионатът присъства предимно в проби от концентрат. Слабата корелация между ацетат-бутиратните оси и пропионатната ос се демонстрира от приблизително 90-градусовия ъгъл между тях и е в съответствие с първоначалния анализ на 1D sTOCSY спектрите, представени по-горе.

Сравнения между диетите

Както се наблюдава на фиг. 3, която показва действителните наблюдения заедно със съответните им парцели, пробите от смесена диета са склонни да произвеждат по-високи нива на емисии на метан (CH4 g/kg DMI, изразени в логаритмична скала) в сравнение с проби от концентрирана диета . Разликата е статистически значима според оценките на LMM (p Фигура 3

В допълнение към това, целият NMR сигнален профил е сравнен между концентрат и смесен тип диета, използвайки PERMANOVA, и са отбелязани статистически значими разлики в средните стойности между тях (p = 0,001).

Предвиждане на производството на метан от ЯМР сигнали на рубца

Два PLS регресионни модела бяха монтирани за производство на CH4 (CH4 g/kg DMI в логаритмична скала), единият включващ само ЯМР сигнали като предиктори, а друг, включително тези, заедно с диетични и животински ковариатори. Таблица 3 обобщава мерките за изпълнение на модела. Корелациите (r) между наблюдаваните и прогнозираните стойности на DMI за CH4 g/kg (в логаритмична скала) са съответно 0.75 и 0.84 за всеки модел (графики на наблюдаваните спрямо предсказаните стойности могат да бъдат намерени в допълнителната фигура 13S). Таблицата също така представя R 2 и RMSE мерки, базирани на кръстосано валидирани и тестови данни, които показват сравними резултати, предполагащи подобрение на R 2 с около 20% и намаляване на RMSE с около 15%, когато се добавят ковариати заедно с NMR сигналите . Имайте предвид, че прилагането на мащабирането на Pareto върху предикторите не подобри производителността на модела и увеличи броя на използваните латентни компоненти.

(A) PCA биплот, базиран на често срещани не-VFA сигнали сред 20-те най-важни сигнала за прогнозиране на добива на метан, получени от резултатите от PLS моделирането. (Б.) PCA биплот на други ЯМР сигнали, показващи силни корелации с топ 20 сигнала. Проби, отличаващи се по тип диета. Съответствието на интегралните идентификатори с отделни метаболити е дадено в текста.

В допълнение 1D sTOCSY идентифицира още няколко метаболита, чиито сигнали не са сред топ 20 класираните интеграли, а именно фенилаланин, аспартат, фенилацетат, ксантин, метанол и метиламин (допълнителна таблица 1S). Проверката на 1D sTOCSY спектрите на хипоксантин и урацил (допълнителни фигури 7S-8S) потвърждава силна корелация на тези сигнали както с глюкоза, така и с аминокиселини, докато 3-фенилпропионат и валерат (допълнителни фигури 9S-10S) показват по-слаба корелация с тези метаболити. Фенилацетат, фенилаланин и аспартат показват силни корелации с глюкозата, повечето идентифицирани аминокиселини (аланин, лизин, левцин) хипоксантин и урацил (допълнителни фигури 4S-8S), което показва връзката им с диетата с концентрат. Въпреки това беше отбелязано, че когато се използват 3-фенилпропионат и валерат като пикове на водача, тази корелация не се наблюдава.

Докато първите две VFA, ацетат и бутират, не корелират с глюкоза, аминокиселини, хипоксантин и урацил, пропионатът показва корелации с тези метаболити (допълнителни фигури 2S, 3S и 4S-8S). Що се отнася до идентифицираните метаболити, които са свързани с метилотрофния път, метанол и метиламин (допълнителни фигури 11S и 12S), и двата присъстваха при ниски концентрации в спектрите. Когато се използва метанол като движещ пик, беше забелязано, че той е по-свързан с ацетат и пропионат, отколкото с бутират. За метиламин се забелязва по-висока асоциация с пропионат в сравнение с ацетат и бутират. И двата метаболита показват връзка с метаболитите, които са свързани с диетата с концентрат.

Дискусия

Настоящото проучване използва NMR за идентифициране на метаболити на търбуха, свързани с емисии на СН4 от месодайни говеда. Основните цели на това проучване бяха да се оцени ЯМР като инструмент за метаболомика, да се определи дали метаболитите, свързани с метилотрофния път, могат да се увеличат с диета с висок процент на концентрат, да се определят ефектите от диетата върху емисиите на СН4 и да се оценят предсказващите способности от тези ЯМР метаболитни сигнали. Получените резултати от това проучване ни помогнаха да постигнем целите си, частично или изцяло, по следния начин.

Метаболитите, които бяха отговорни за предсказуемата способност на нашите модели, описани по-горе, без VFA, също бяха много сходни с проучването на Saleem и др. 39, който заключава, че 10-те метаболити, които са отговорни за обяснението на разликата между диетата от 15% до 45% от ечемик, включват путресцин, аспартат, аланин, глюкоза, метиламин, ферулат и формиат. Тези метаболити са подобни на тези, идентифицирани в нашето проучване с глюкоза, аланин и путресцин, които присъстват в първите 20 идентифицирани (Фиг. 4А). Разликите в най-добрите предиктори между диетите могат да се отдадат на факта, че тази разлика може да се забележи, когато производствените нива са много високи 11,39 .

Това проучване показва потенциала за използване на метаболити като предиктори за емисиите на CH4 при месодайните говеда, допринася за изграждане на знания за използването на ЯМР като инструмент за получаване, количествено определяне и идентифициране на метаболитите на търбуха и предоставя ценна информация за това как различните видове диети променят околната среда на търбуха на метаболитно ниво. Бъдещите проучвания в тази област биха се възползвали от по-голяма база данни за метаболити за идентификация, която би позволила по-добро разбиране кои метаболити са пряко свързани с производствените пътища на СН4 в червея и следователно да подобри използването на метаболитите като предсказващ инструмент за емисиите на СН4.