електрическо поле

SDS-PAGE (електрофореза с натриев додецил сулфат-полиакриламиден гел) обикновено се използва в лабораторията за разделяне на протеини въз основа на тяхното молекулно тегло. Това е една от онези техники, които се използват често, но често не се разбират напълно. Така че нека опитаме и поправим това.

SDS-PAGE разделя протеините според тяхното молекулно тегло въз основа на диференциалните им скорости на миграция през пресяваща матрица (гел) под въздействието на приложено електрическо поле.

Осъществяване на степента на миграция на протеини пропорционална на молекулярното тегло

Движението на всеки зареден вид през електрическо поле се определя от неговия нетен заряд, неговия молекулен радиус и големината на приложеното поле. Но проблемът с естествено сгънатите протеини е, че нито нетният им заряд, нито молекулният им радиус зависят от молекулното тегло. Вместо това техният нетен заряд се определя от аминокиселинния състав, т.е. сумата от положителните и отрицателните аминокиселини в протеина и молекулния радиус от третичната структура на протеина.

Така че в своето естествено състояние различни протеини с еднакво молекулно тегло биха мигрирали с различна скорост в електрическо поле в зависимост от техния заряд и 3D форма.

За да отделим протеините в електрическо поле само въз основа на тяхното молекулно тегло, трябва да унищожим третичната структура, като намалим протеина до линейна молекула и по някакъв начин да маскираме вътрешния нетен заряд на протеина. Там идва SDS.

Ролята на SDS (и др.)

SDS е детергент, който присъства в пробния буфер на SDS-PAGE, където заедно с малко кипене и редуциращ агент (обикновено DTT или B-ME за разграждане на протеиново-протеиновите дисулфидни връзки), той нарушава третичната структура на протеини. Това намалява сгънатите протеини до линейни молекули.

SDS също така покрива протеина с равномерен отрицателен заряд, който маскира присъщите заряди на R-групите. SDS се свързва доста равномерно с линейните протеини (около 1,4 g SDS/1 g протеин), което означава, че зарядът на протеина вече е приблизително пропорционален на молекулното му тегло.

SDS също присъства в гела, за да се увери, че след като протеините са линеаризирани и техните заряди маскирани, те остават такива през целия цикъл.

Доминиращият фактор за определяне на протеин, покрит със SDS, е неговият молекулен радиус. Доказано е, че протеините, покрити с SDS, са линейни молекули, широки 18 ангстрема и с дължина, пропорционална на тяхното молекулно тегло, така че молекулният радиус (и следователно тяхната подвижност в гела) се определя от молекулното тегло на протеина. Тъй като протеините, покрити с SDS, имат същото съотношение заряд към маса, няма да има диференциална миграция въз основа на заряда.

Гел матрицата

В приложено електрическо поле протеините, третирани с SDS, сега ще се движат към положителния анод с различни скорости в зависимост от тяхното молекулно тегло. Тези различни мобилности ще бъдат преувеличени поради средата с високо триене на гел матрица.

Както подсказва името, гел матрицата, използвана за SDS-PAGE, е полиакриламид, което е добър избор, тъй като е химически инертен и от решаващо значение може лесно да бъде направен при различни концентрации, за да се получат различни размери на порите, давайки различни условия на разделяне които могат да се променят в зависимост от вашите нужди. Може би си спомняте, че преди това написах статия за механизма на полимеризация на акриламида.

Прекъснатата буферна система и гелът за подреждане - подреждат ги на стартовата линия

За провеждане на тока от катода (отрицателен) към анода (положителен) през гела, очевидно е необходим буфер. Предимно използваме прекъснатата буферна система Laemmli. „Прекъснато“ означава просто, че буферът в гела и резервоара са различни.

Обикновено системата е настроена с гел за подреждане при pH 6.8, буфериран от Tris-HCl, течащ гел, буфериран до pH 8.8 от Tris-HCl и електроден буфер при pH 8.3. Подреждащият гел има ниска концентрация на акриламид, а работещият гел - по-висока концентрация, способна да забави движението на протеините.


И така, какво е с всички тези различни рН?

Е, глицинът може да съществува в три различни състояния на зареждане, положително, неутрално или отрицателно, в зависимост от рН. Това е показано на диаграмата по-долу. Контролът на зарядното състояние на глицина от различните буфери е ключът към цялото подреждане на гела.

Ето как работи гелът за подреждане. Когато захранването е включено, отрицателно заредените глицинови йони в рН 8,3 електродния буфер са принудени да влязат в гела за подреждане, където рН е 6,8. В тази среда глицинът преминава предимно в цвиттерионно (неутрално заредено) състояние. Тази загуба на заряд ги кара да се движат много бавно в електрическото поле.

Клионите (от Tris-HCl), от друга страна, се движат много по-бързо в електрическото поле и образуват йонен фронт, който мигрира пред глицина. Отделянето на Cl- от Tris противоиона (който сега се движи към анода) създава тясна зона със стръмен градиент на напрежението, който дърпа глицина зад себе си, което води до две тясно разделени фронтове на мигриращи йони; силно подвижният Cl-фронт, последван от по-бавния, предимно неутрален глицинов фронт.

Всички протеини в пробата с гел имат електрофоретична подвижност, която е междинна между крайността на подвижността на глицина и Cl-, така че когато двата фронта преминават през пробата добре, протеините се концентрират в тясната зона между Cl - и глицинови фронтове.

И те са изключени!

Тази процесия продължава, докато не достигне течащия гел, където рН превключва на 8,8. При това рН молекулите на глицин са най-вече отрицателно заредени и могат да мигрират много по-бързо от протеините. Така че глициновият фронт се ускорява покрай протеините, оставяйки ги на прах.

Резултатът е, че протеините се изхвърлят в много тясна лента на границата на подреждането и течащите гелове и тъй като течащият гел има повишена концентрация на акриламид, което забавя движението на протеините в зависимост от техния размер, разделянето започва.

Какво беше всичко това?

Ако все още се чудите защо е необходим гелът за подреждане, помислете какво би се случило, ако не сте използвали такъв.

Ямките с гел са дълбоки около 1 см и обикновено трябва да ги напълните значително, за да получите достатъчно протеин върху гела. Така че при липса на гел за подреждане, вашата проба ще седи върху въртящия се гел, като лента с дълбочина до 1 см.

Вместо да бъдат подредени заедно и да удрят течащия гел заедно, това би означавало, че протеините във вашата проба ще влязат в бягащия гел по различно време, което води до много размазани ленти.

Така подреждащият гел гарантира, че всички протеини пристигат в работещия гел едновременно, така че протеините със същото молекулно тегло ще мигрират като стегнати ивици.

Разделяне

След като протеините са в течащия гел, те се разделят, тъй като протеините с по-високо молекулно тегло се движат по-бавно през порестия акриламиден гел, отколкото протеините с по-ниско молекулно тегло. Размерът на порите в гела може да бъде променен в зависимост от размера на протеините, които искате да отделите, като промените концентрацията на акриламид. Типичните стойности са показани по-долу.

За по-широк диапазон на разделяне или за протеини, които трудно се отделят, може да се използва градиентен гел, който има слоеве с повишаваща се концентрация на акриламид.

Мисля, че това е всичко за Laemmli SDS-PAGE. Ако имате някакви въпроси, корекции или нещо допълнително за добавяне, моля, включете се в раздела за коментари!

Първоначално публикувано на 18 септември 2008 г. Преработено и актуализирано на 20 юни 2016 г.

Това помогна ли ви? Тогава, моля, споделете с вашата мрежа.