Показатели: PDF 1056 преглеждания | HTML 3016 изгледи | ?

терапия

Силвия Видали, Сепиде Аминзаде-Гохари, Рене Гюнтер Файхтингер, Рено Ватринет, Андреас Колер, Феликс Локър, Триша Ръдърфорд, Маура О’Донъл, Андреа Щьогер-Клайбер, Бриджит Ламберт, Томас Клаус Фелдер, Волфганг Шперлер и Барбара Колер Фелдър

Резюме

Силвия Видали 1, Сепиде Аминзаде-Гохари 1, Рене Гюнтер Файхтингер 1, Рено Ватринет 2, Андреас Колер 1, Феликс Локър 1, Триша Ръдърфорд 3, Маура О'Донел 3, Андреа Щьогер-Клайбер 3, Бриджит Ламберт 3, Томас Клаус Фелдер 4, Волфганг Шперл 5 и Барбара Кофлер 1

1 Експертен център на Лора Баси-THERAPEP, Изследователска програма за рецепторна биохимия и туморен метаболизъм, Катедра по педиатрия, Медицински университет Парацелз, Залцбург, Австрия

2 Катедра по фармация и биотехнологии (FABIT), Университет в Болоня, Болоня, Италия

3 Clinical Nutrition, Vitaflo International Ltd, Ливърпул, Великобритания

4 Катедра по лабораторна медицина, Медицински университет Парацелз, Залцбург, Австрия

5 Катедра по педиатрия, Медицински университет Парацелз, Залцбург, Австрия

Ключови думи: бъбречно-клетъчен карцином, митохондрии, кетогенна диета, метаболизъм, ефект на Варбург

Получено: 10 март 2017 г. Прието: 27 юни 2017 г. Публикувано: 17 юли 2017 г.

ВЪВЕДЕНИЕ

Ракът на бъбреците е един от 10-те най-разпространени видове рак в западните страни, като представлява приблизително 2-3% от злокачествените заболявания при възрастни, а бъбречно-клетъчният карцином (RCC) включва приблизително 90% от всички бъбречни ракови заболявания [1, 2]. При пациенти с ограничено заболяване на органите хирургичната резекция е стандартната терапия и има отлични резултати [3]. Доказано е, че други съвременни лечения, като съдов ендотелен растежен фактор (VEGF), тромбоцитен растежен фактор (PDGF) и цел на бозайници за антитела и инхибитори на рапамицин (mTOR), увеличават преживяемостта без прогресия, но отговорът е по-скоро преходно [4]. Освен това RCC често се диагностицира на късен етап, когато лечебното лечение не е възможно. Всъщност метастатичният RCC е силно устойчив на лечение, като резултатите са обикновено лоши и средната преживяемост след диагнозата е по-малка от една година [1, 5].

Много туморни клетки показват специален метаболитен подпис, характеризиращ се с високо усвояване на глюкоза и аеробна гликолиза, която дори в присъствието на достатъчно количество кислород предотвратява метаболизма на пирувата от дишането на митохондриите, а именно окислително фосфорилиране (OXPHOS) [6–9] . Този метаболитен превключвател е известен като ефектът на Варбург [10, 11]. В повечето случаи тази промяна в метаболизма е придружена от общо регулиране надолу на активността на OXPHOS [12–15], или може да включва дефицит на два или три от комплекса OXPHOS [16, 17], или единичен дефект на един от субединиците OXPHOS [18–20].

RCC също показва ефекта на Варбург. Всъщност при RCC се наблюдава увеличаване на гликолитичните протеини и изчерпване на няколко митохондриални ензими [12, 21]. Освен това, по-агресивните видове RCC се характеризират със стабилизиране на хипоксично-индуцируем фактор (HIF), дори при нормоксия, поради загуба на функцията на гена на фон Hippel-Lindau (VHL). HIF също допринася за регулиране на много гликолитични ензими и потискане на митохондриалното окисление на глюкозата [4, 22].

Кетогенната диета (KD) е с високо съдържание на мазнини и ниско съдържание на въглехидрати и протеини и имитира глад или продължителни упражнения, без да ограничава приема на енергия. Характеризира се с повишени нива на кетон в тялото (напр. Ацетоацетат и β-хидроксибутират) и намалени нива на глюкоза в кръвта. Тъй като туморните клетки силно зависят от глюкозата за производство на енергия, ограничаването на доставката на глюкоза чрез KD може да има антитуморни ефекти. Освен това се съобщава, че KD насърчава имунитета, намалява както възпалението, така и ангиогенезата и увеличава апоптозата [23-25]. И накрая, KD показа добър потенциал за повишаване на чувствителността на раковите клетки към химиотерапия и за защита на нормалните клетки от лъчетерапия. По този начин, KD позволява лечение на рак с по-ниски дози химиотерапевтични средства, което също може да подобри комплайънса на пациентите [6, 26, 27].

Наскоро беше доказано, че KD е особено ефективен при лечението на мозъчни тумори като злокачествен глиом [25, 28] и се прилага в няколко клинични проучвания като адювантна терапия за глиобластом, астроцитом, тумори на стомашно-чревния тракт и други напреднали метастатични видове рак [28–32]. В повечето случаи пациентите показват стабилно заболяване или общо клинично подобрение, с повишена преживяемост без прогресия. В единичен случай имаше рецидив на тумора след суспензия на KD [24].

В предклинични проучвания KD дава отлични резултати като адювантна терапия при лечението на невробластом при миши модел на ксенографт [6, 33]. Невробластомът и RCC имат подобен метаболитен подпис, с намалено съдържание на митохондриална ДНК и общо намаляване на OXPHOS активността [9, 12]. Има доказателства, че KD, базирани на средноверижни триглицериди (MCT), са толкова ефективни при диетичното управление на неразрешима епилепсия, колкото тези, базирани на дълговерижни триглицериди (LCT) [34], и MCT е включен в KD, тъй като се метаболизира по-бързо и е по-малко вероятно да се съхраняват в мастна тъкан в сравнение с LCT [35, 36]. Въз основа на тези предпоставки предположихме, че пациентите с RCC също могат да се възползват от терапията с KD. По този начин, за да изясним дали KD може да се използва като потенциален адювант при лечението на RCC, създадохме ксенотрансплантати на човешки RCC при имунодефицитни мишки и рандомизирахме мишките в контролна диетична група и в три KD групи със или без обогатяване на MCT.

РЕЗУЛТАТИ

Човешки RCC ксенотрансплантати имат подобни дихателни характеристики като човешки RCC

За да гарантираме, че човешките RCC ксенотрансплантати на 786-O клетки имат подобни дихателни характеристики като човешките RCC, ние извършихме имунохистохимично (IHC) оцветяване на 5-те OXPHOS комплекса и порина (маркер на митохондриална маса) върху RCC 786-O ксенографтни тъканни участъци. Ксенотрансплантатите показват нормална митохондриална маса, но значително по-ниски нива на OXPHOS комплекси I – IV в сравнение с нормални бъбреци (Фигура 1), в съответствие с публикуваните по-рано данни за дихателно увреждане при проби от човешки RCC [12]. По този начин тези резултати потвърждават общо намаляване на аеробния митохондриален метаболизъм в модела RCC 786-O xenograft.

Фигура 1: RCC показва намалени нива на OXPHOS комплекси I – IV. Извършено е имунохистохимично оцветяване на порин и комплексите OXPHOS (A1 – F1) върху нормален човешки бъбрек, (A2 – F2) и на RCC ксенографти. (A3 – F3) Графиките показват бални стойности на интензивността на оцветяване. Данните са дадени като средно ± SEM. Статистическият анализ беше извършен чрез използване на студентски т тест (несдвоени проби), ## стр Фигура 2: KD обикновено причиняват намаляване на растежа на тумора, но също така и оцеляване. (А1 – А4) Растеж на тумора при отделни мишки при различни диети. (Б.) Графиката показва средната стойност на туморната маса по време на лечението. Данните са дадени като средно ± SEM. Статистическият анализ беше извършен с помощта на двупосочен ANOVA (тест за многократно сравнение на Dunnett), н = 5 за CTRL и LCT/MCT8 групи; н = 6 за групите LCT и LCT/MCT10, в началото на диетичната интервенция. (° С) Криви на преживяване на Каплан-Майер за реципиентите на RCC ксенотрансплантат, лекувани с различните KD. Статистическият анализ за кривите на оцеляване е направен с теста Log-rank (Mantel-Cox): CTRL срещу LCT, стр = 0,2414; CTRL срещу LCT/MCT8, стр = 0,1205; CTRL срещу LCT/MCT10, стр = 0,0204.

Интересното е, че мишките с RCC ксенотрансплантати често изпитват масивна и обикновено внезапна загуба на тегло, което е по-лошо във всички групи с KD в сравнение с групата CTRL (Фигура 3A1-3A4). Загубата на тегло над 20% е единствената причина за преждевременното прекратяване на лечението и евтаназията. Мишките, приемащи някоя от съдържащите MCT диети, са имали изразена загуба на тегло. В групата CTRL мишките поддържаха доста стабилно телесно тегло до 50–60 дни (Фигура 3A1). В впечатляващ контраст, всички мишки, носещи тумор, получаващи LCT диета, са имали загуба на тегло след 26–30 дни лечение и 67% от тях са загубили повече от 20% от първоначалното си тегло (Фигура 3А2). В групата LCT/MCT8 40% са имали значителна загуба на тегло след 15–20 дни (Фигура 3A3), а в групата LCT/MCT10 около 70% от мишките са започнали да отслабват още 10 дни след началото на лечението (Фигура 3A4). Мишките, които изпитват загуба на тегло, изглеждаха малко летаргични (данните не са показани, субективно наблюдение на експериментатора).

Когато размерът на тумора достигне 600–700 mm 3, мишките са били рандомизирани в различни дивизионни групи ad libitum (н = 5–6) и групово настанени. Получателите на ксенотрансплантат се наблюдават два пъти седмично за телесно тегло с помощта на цифрова скала и обем на тумора чрез използване на шублер и изчисляване на обема по формулата (ширина × височина × дължина)/2. Нивата на кръвната глюкоза и кетонното тяло (β-хидроксибутират) се проследяват веднъж седмично, като се използва специфичен ензимно-базиран комплект (Precision Xceed, Abbott Laboratories, Австрия). Измерванията се извършват след двучасово гладуване.

За ксенотрансплантатите мишките бяха евтаназирани 65 дни след инжектиране на туморни клетки или когато бяха постигнати критерии за прекратяване, такава загуба на тегло над 20% от нетното телесно тегло; нито една от мишките не е скарифицирана поради размера на тумора, тъй като нито един от ксенотрансплантатите не е достигнал размера на терминацията от 10% от нетното тегло на мишката. Един филий с дебелина 5 mm от централната част на тумора беше фиксиран с формалин и парафин за хистологичен анализ, а останалата ракова тъкан беше бързо замразена в течен азот. Черният дроб също беше събран и бързо замразен в течен азот. И накрая, преди да бъдат убити, мишките се инжектират с 10 μl/g анестетична смес (кетамин 20,5 mg/ml, ксилазин 5,4 mg/ml, ацепромазин 270 μg/ml във физиологичен разтвор) и след проверка за липса на рефлекси от лапа, беше извършена пункция на сърцето и кръвта беше събрана в епруветки (BD Microtainer ® PST TM LH епруветки) (BD Biosciences, Австрия). Както е предложено в производствения протокол, епруветките са обърнати 10 пъти и центрофугирани при 10000g за 90 секунди, за да се отдели плазмата; След това се събира плазма и се замразява бързо в течен азот.

Експериментът върху здрави животни беше прекратен след 40-дневно лечение и беше приложен същият протокол за евтаназията и пробните колекции, използвани за мишки, носещи ксенотрансплантат. Всички замразени проби се съхраняват при -80 ° C до анализ.

Диетична намеса

Мишките бяха рандомизирани в четири диетични групи, хранени по желание: контролна диета (CTRL); дълговерижна мастна киселина KD (LCT); 25% 8-въглеродни средноверижни мастни киселини и 49,6% LCT KD (LCT/MCT8); и 25% средноверижни мастни киселини с 10 въглерода и 49,6% LCT KD (LCT/MCT10) (Sniff Spezialdiäten GmbH, Германия). Освен това диетите са обогатени с витамини и минерали (Таблица 1).

Таблица 1: Състав и енергийно осигуряване на различните диети