Промени във вътреклетъчната концентрация на Ca 2+ в сърдечните фибробласти в зависимост от плътността на културата. (A, B) индуцирани от AngII преходни процеси на Ca 2+ в първични CF в присъствието на 2 mM извънклетъчни Ca 2+. Клетките се анализират 5 дни след изолирането и култивирането при ниска (А) или висока плътност (В). Включени са флуоресцентни изображения на заредени с Fura-2 клетки. (C, D) Индуцирано от AngII освобождаване на Ca 2+ от вътрешните запаси и последващо въвеждане на Ca 2+, индуцирано от AngII, се анализират във фибробласти, поддържани при условия с ниска (C) или висока плътност (D). Освен това експресията на α-SM-актин се анализира върху клетки, култивирани върху всяка клетъчна плътност (горни панели). n = брой независими препарати (сърца).

вписване

Индуцирано от AngII освобождаване на Ca 2+ и навлизане на Ca 2+ при отсъствие на TRPC3/C6 или след предварително третиране с TGF-β. (A) Индуцирано от AngII освобождаване на Ca 2+ и влизане на Ca 2+ в първични CF от WT (черни) и TRPC3/C6-DKO (червени) мишки. Освобождаването на Са 2+ се измерва в отсъствието на извънклетъчен Са 2+ (300 цМ EGTA) и влизането на Са 2+ се наблюдава в присъствието на 2 тМ извънклетъчен Са 2+. Ляв панел: Оригинални следи и десен панел: Средни стойности от три независими препарата (сърца). (Б) Измервания, извършени както в (А), но в клетки, предварително инкубирани (10 минути) с TRPC3/C6/C7 антагонист SAR7334 (1 цМ). (C) Индуцирано от AngII освобождаване на Ca 2+ и навлизане на Ca 2+ в първични CF от WT мишки, култивирани в присъствието на 10 ng/mL TGF-β (зелено) или при контролни условия (черно). Ляв панел: оцветяване на α-актин в гладката мускулатура след третиране с TGF-β, средни панели: Оригинални следи от измервания на Ca 2+ и десен панел: Средни стойности от 3 независими препарата. n = брой независими препарати (сърца). Всички клетки се анализират 5 дни след изолирането и се култивират при висока плътност. * p t -тест.

Индуцирано от AngII освобождаване на Ca 2+ и навлизане на Ca 2+ в сърдечните фибробласти в отсъствието на всичките седем TRPC протеина. (A) AngII- и (B) индуцирани от тромбин Ca 2+ преходни процеси в първични CF от WT (черно) и TRPC-хепта (Trpc1/2/3/4/5/6/7 -/-) KO (червено) мишки. Ca 2+ преходни процеси бяха измерени в присъствието на 2 mM извънклетъчни Ca 2+. Ляв панел: Оригинални следи и десен панел: Средни стойности на три независими препарата (сърца). (C) Индуцирано от AngII освобождаване на Ca 2+ и въвеждане на Ca 2+ в първични CF от WT (черни) и TRPC-hepta KO (червени) мишки. Освобождаването на Са 2+ беше измерено в отсъствието на извънклетъчен Са 2+ (300 цМ EGTA) и влизането на Са 2+ беше проследявано в присъствието на 2 тМ извънклетъчен Са 2+. Ляв панел: Оригинални следи и десен панел: Средни стойности на три независими препарата. (D) Ефектът на CRAC блокера (10 цМ) GSK7975A върху индуцираното от AngII освобождаване на Ca 2+ беше анализиран в CF от WT мишки, както в (C). Ляв панел: Оригинални следи и десен панел: Средни стойности на три независими препарата. n = брой независими препарати (сърца). Всички клетки се анализират 5 дни след изолирането и се култивират при висока плътност. * p p t -тест.

Резюме

1. Въведение

2. Материали и методи

2.1. Експерименти с животни

2.2. Изолиране и първична култура на сърдечни фибробласти (CF)

24 ° C) -наситена TS, съдържаща 1000 U/mL хепарин, 200 цМ EGTA и 10 тМ 2,3-бутандион-моноксим за около 7 минути (докато останалата кръв е напълно отстранена). След това перфузионният разтвор беше сменен на постоянно газообразен (карбоген) и закален (36 ° C) TS, съдържащ смес от колагеназа/протеаза (Liberase TM, Roche Applied Science, Pleasanton, CA, USA) при крайна концентрация от 133 µg/ml за 2–6 минути (в зависимост от размера и възрастта на сърцето). Температурата на перфузата се поддържа или на 35 ° C, или RT (24-25 ° C), но не се наблюдават очевидни разлики на изолираните клетки. След това вентрикулите бяха изолирани от предсърдията, дисектирани и прехвърлени в TS, допълнена с 5% говежди серумен албумин (BSA), 12,5 цМ Ca2Cl и 1,4 ng/ml DNase I (Sigma-Aldrich Мюнхен, Германия). Вентрикулите бяха нарязани на малки парчета, последвано от нежна хомогенизация на тъканта с помощта на нарязан и полиран 1000 µL пластмасов връх. Суспензията (краен обем

10 ml) се филтрира през найлонов филтър (размер на порите 150 µm, Sysmex, Norderstedt, Германия) и се поддържа в продължение на 10 минути (37 ° С) в същия разтвор за утаяване; кардиомиоцитите са концентрирани главно в пелетата. Останалите в супернатантата фибробласти се прехвърлят в епруветка от 15 ml и останалите кардиомиоцити се отстраняват чрез кратък етап на центрофугиране от 48 × g (1 min, Megafuge 1.0 R, Heraeus, Hanau, Германия). Супернатантата се прехвърля в нова епруветка и клетките се концентрират в гранула чрез центрофугиране (324 х g, 10 минути); след отстраняване на останалите TS клетките се промиват веднъж със среда 199 (FG0615, Merck, Дармщат, Германия). И накрая, клетките бяха ресуспендирани внимателно в 5 ml среда 199, допълнена с 2,5% пеницилин/стрептомицин (151401222, Gibco, ThermoFisher Scientific, Waltham, MA), 50 µg/ml канамицин (A1493, Аплихем, Дармщат, Германия), 0,1 µM инсулин (I6634, Sigma-Aldrich) и 10% FCS (10270-106, Gibco). Клетките се засяват в 25-сантиметрова културна колба (едно сърце на колба) и се поставят в клетъчен инкубатор (5% СО2, 37 ° С) за 2 часа. След това средата беше сменена, за да се отстранят останалите тъкани и незакрепените клетки. След период на инкубация от 24 часа клетките се отделят от колбата с култура чрез третиране с трипсин (1% в DPBS и 0,2 mM EDTA) (