Субекти

Резюме

Краниофациалната реконструктивна хирургия изисква биоактивен костен имплант, способен да осигури постепенна резорбируемост и да се адаптира към кинетиката на новообразуване на костите по време на зарастване. Понастоящем се предлагат биоматериали, изработени от калциев фосфат или биоактивни стъкла, главно като пълнители на костни дефекти, но все още се изисква гъвкава техника за обработка, за да се произвежда биокерамика с градиентен състав за приложение като контролирани резорбционни импланти. Тук се съобщава за прилагането на бързо прототипиране на базата на лазерна облицовка за производство на триизмерни биокерамични импланти, състоящи се от вътрешна сърцевина на калциев фосфат, с умерена инвитро разграждане при физиологично рН, заобиколено от биоактивен стъклен външен слой с по-висока разградимост. Всеки компонент на импланта е валидиран по отношение на химични и физични свойства и липса на токсичност. Анализите на адхезия и пролиферация на преостеобластните клетки разкриват прилепването и растежа на нови костни клетки върху материала. Тази техника осигурява импланти с постепенна резорбируемост за възстановяване на ниско натоварваща кост.

Въведение

импланти

Схематична илюстрация на изработката, съобразена с импланта, от диагностика на дефекти и на подхода, следван в тази работа за постигане на прогресивно резорбиран материал. (а) Компютърните техники за изобразяване предоставят триизмерни данни за костния дефект, които се използват за проектиране на компютърен модел на необходимия имплант, произведен впоследствие чрез техника за бързо прототипиране. (б) Външният слой от биоактивно стъкло (BG) (горе вляво) на импланта се резорбира в начален етап от физиологичната течност, благоприятствайки утаяването на остеопроводим HA слой и диференциацията на остеобластните предшественици, необходими за интензивно костно образуване. Впоследствие вътрешният многофазен CaP се резорбира бавно чрез посредничество на остеокласти и физиологична течност, освобождавайки химически видове, които насърчават израстването на костите и осигуряват стабилност в дългосрочен план.

В това проучване представяме нов метод на производство с помощта на лазер за персонализирани костни импланти, предназначен за пациенти, подложени на реконструктивна хирургия. Уникалният имплант е съставен от CaP модифицирана вътрешна сърцевина с умерена степен на разграждане и BG външен слой с по-висока разградимост, както е обяснено на фиг. 1b. Тази техника осигурява метод за производство на импланти с постепенна резорбируемост за възстановяване на костите с ниско натоварване, с възможности за интегриране на специфични агенти, индуциращи антибактериална, ангиогенна или антирезорбтивна активност. Лазерната облицовка вече е приложена в нейната двуизмерна версия за производство на калциево фосфатни покрития 41,42,43,44,45,46 и биоактивни стъклени покрития 47 върху титанови сплави за биомедицински приложения.

Резултати

Генерирането на междинна течна фаза е ключова характеристика на тази техника с помощта на лазер, която е необходима за получаване на фини хомогенни слоеве. Той избягва изискването за допълнителни свързващи вещества (които са токсични или намаляват биоактивността) за консолидиране на CaP според геометрията, определена в предоперативната оценка и хирургичното планиране. В допълнение, наличието на течна фаза с по-ниско повърхностно напрежение води до повърхности, свободни от оксиапатит, с последици за резорбируемостта на имплантите и биоактивното поведение и особено за възможността от химични реакции при по-нататъшна обработка с различни биокерамични материали като силикатни BG. Макроскопичните проби от CaP се получават чрез подреждане на променлив брой слоеве: обикновено пробите се обработват от 20 до 320 подредени слоя с дебелина на слоя между 100 и 300 микрометра и скорост на охлаждане от 100 ° C/min, за да се запази целостта на материала (вж. Фиг. 2а).

Външна обвивка: Лазерна облицовка на силно резорбируемо биоактивно стъкло

Вътрешна сърцевина-външна обвивка на черупката в постепенно резорбируем материал

За да създадем преход между силно резорбируемата повърхност на BG и многофазното ядро ​​на CaP, ние депонирахме BG слоеве върху предварително обработени CaP импланти. След като вътрешното ядро ​​е завършено чрез добавяне на последния слой CaP и температурата на материала е спаднала до 500 ° C по време на процеса на охлаждане, частиците BG се напръскват върху повърхността му с помощта на вторична дюза и се прилага лазерно облъчване. По същество консолидираното вътрешно ядро ​​на CaP се превръща в субстрат за външните слоеве на BG. Дебелината на стъклото от 200 μm до 500 μm може да се отлага в един слой (фиг. 4а), но по-високи дебелини могат да се постигнат чрез подреждане на последователни слоеве в посока, перпендикулярна на повърхността.

Елементен състав и линейно сканиране на спектрите на Raman shift на интерфейса между ядрото на CaP и външния слой S520 BG. (а) Общ преглед на SEM на външния капак на S520 BG. (б) Елементен състав, получен чрез енергийно дисперсионна рентгенова спектроскопия (EDS) микроанализ в интерфейсната зона. (° С) и (д) Раманов спектър в интерфейсната зона.

TEM анализ на интерфейса между вътрешното ядро ​​на CaP и външния BG слой. (Горен център) SEM микрофотография, показваща зоната, отстранена чрез FIB техника и останалата ламела между интерфейса и отложеното стъкло. (Долен център) Пропускаща електронна микрофотография на центъра на ламелите, показваща кристално-аморфната граница. (Долу вляво) SAED на интерфейса, разкриващ характерния дифракционен модел на β-ренанит (β-NaCaPO4). (Долу вдясно) SAED на съвсем близо BG до интерфейса потвърждава аморфното състояние.

Схематична илюстрация на структурната подредба в индивидуалния за пациента биокерамичен имплант и профила на освобождаване на калций на повърхността и вътрешната сърцевина. (а) Повърхността на импланта, непосредствено съседна на трепанирания костен ръб, включва разстроена силикатна тетраедрична мрежа, отворена от повишена концентрация на модифициращи катиони. Силно реактивната BG структура е гладко свързана с по-малко реактивната многофазна моноклинна подредба на фосфатни тетраедри и катиони Ca 2+ чрез орторомбична кристална решетка с намаляващо присъствие на Na + катиони. (б) Профил на освобождаване на Ca 2+ в Tris-HCl буфер за предшественик на HA, голи многофазни CaP преди лазерно облицоване с BG и на проби с външни слоеве S520 BG.

Структурните промени на външната обвивка на BG са измерени след процеса чрез последователно получаване на микро-Раманов спектър на различни разстояния от интерфейса. Мрежовата свързаност е тясно свързана със стъклената биоактивност 57, стъклата с висока мрежова свързаност (по-голяма от 2,4) се характеризират с ниска разградимост и инертен биологичен отговор, докато силно нарушените мрежи водят до по-бързо разтваряне. Забелязахме, че стъклената структура е забележително по-отворена в райони близо до зоната на интерфейса, което означава, че в този момент не се образува пасивиращ слой. Стъклената структура се затваря от интерфейса навън, достигайки свързаността на предшественика със стъклената структура на няколко микрометра от интерфейса. Поради ниската тенденция на кристализация на S520 BG, от тази точка близо до границата на повърхността, Рамановите спектри са идентични с тези на предшественика и следователно структурата на стъклото и неговата реактивност съответстват на използваното предшественик стъкло.

Механичните свойства на тези импланти с лазерно инженерство позволяват използването им при приложения с ниско натоварване. Якостта на натиск, 359 ± 51 MPa, е доста над якостта на натиск на кората на кората 35. Твърдостта на биоактивния стъклен външен слой и сърцевината на CaP, 454 ± 30 и 443 ± 19 HV и жилавостта на разрушаване КIC 0,91 ± 0,13 и 1,29 ± 0,17 MPa · m 1/2, съответно съответстват на отчетените стойности за биоактивни стъкла и CaP звукова керамика 35,58 .

Благодарение на последователната обработка на CaP и BG слоеве чрез бързо прототипиране на базата на лазерна облицовка, ние получихме уникални имплантни материали, съдържащи многофазно CaP ядро, заобиколено от BG покритие. Според тестовете за разградимост във физиологични среди, се очаква външните слоеве на BG да бъдат високи in vivo реактивност, адекватна на скоростите на костен растеж в ранните времена на имплантиране, докато многофазното ядро ​​на CaP осигурява по-ниски нива на разградимост и гарантира функцията на импланта в дългосрочен план (вж. фиг. 6б) Количеството на всеки материал в импланта може да бъде съобразено, като по този начин позволява адаптиране на нивата на резорбция и остеокондукция на всяко място в импланта и подобряване на постепенното му заместване с новообразувана кост. Освен това, характеристиките на инжектиране на частици позволяват подобряване на повърхността със специфични характеристики от биологично значение, например антибактериална или ангиогенна активност, чрез включване на допълнителни частици като Ag2O, ZnO, Co3O4 или SrO.

Заключение

Демонстрирахме възможността за производство на уникални импланти за възстановяване на костите с ниско натоварване чрез прилагането на бързо прототипиране на базата на лазерна облицовка с помощта на CaP и BG частици. Методът на обработка се характеризира с използването на лазерен лъч с висока мощност за производството на самоподдържащ се разтопен материал, без форми, добавки или изисквания за последваща обработка. Имплантите се характеризират със съобразено разпределение на многофазен CaP с ниска резорбируемост в сърцевината и силно реактивен BG на повърхността, които са свързани чрез образуването на биоактивен интерфейс на натриев калциев фосфат. Биоактивността и скоростта на разграждане на частиците на прекурсора на BG се запазват след отлагане на външните слоеве. Универсалността на този тип импланти отваря врати за редица приложения, като например in vivo проучвания за определяне на оптималния разрез и пропорциите на CaP и BG, необходими, за да съответстват на новата скорост на нарастване на костите за всеки конкретен случай.

експериментална секция

Синтез на биоактивни частици от стъкло

Използвани са реагенти с висока чистота (Sigma-Aldrich) за синтезиране на биоактивни стъкла със състави, еквивалентни на тези на 45S5 биоактивно стъкло (46.1 SiO2, 26.9 CaO, 24.4 Na2O, 2.6 P2O5; моларни%) и S520 биоактивно стъкло (52.0 SiO2, 18.0 CaO, 20,9 Na2O, 2,0 P2O5, 7,1 K2O; моларни%). Прекурсорните смеси се подлагат на топене (1,5 часа при 1400 ° С) и последващо рафиниране за 1 час в Pt тигел. Стъклените стопилки бързо се гасят в дейонизирана вода и впоследствие се сушат. Получените стъклени фрити се смилат и пресяват между 100 µm и 250 µm, за да се подобри течливостта през газовия твърдофазен инжектор.

Синтез на многофазно ядро ​​от калциев фосфат

Покритие с биоактивно стъкло

След отлагане на последната насложена лента, калциево-фосфатната сърцевина се завърта в необходимото положение за покриване с биоактивното стъкло. Биоактивните стъклени частици се инжектират в зоната на взаимодействие с помощта на втори инжектор. В този етап от процеса последователно нанесените биоактивни стъклени ленти не се наслагват, а се припокриват, за да се получи двумерно покритие. Лазерният лъч и праховият поток се дефокусират при тази втора конфигурация, за да покрият по-висока повърхност; масовият поток на биоактивно стъкло се поддържа постоянен при 20 mg/s. Стойност от 45 J/mm 2 е избрана за енергийната плътност на обработка на близкия инфрачервен лазерен лъч (дължина на вълната λ = 1064 nm) за биоактивни дебелини на стъклото под 500 μm. За дебелини над 500 μm е използвана по-дълга дължина на вълната λ = 10600 nm (мощен CO2 лазер, Rofin) за увеличаване на енергийното свързване към мрежата от силикатно стъкло; този лазерен източник работи при енергийна плътност 25 J/mm2. Обемният поток на носещия газ е равен на 1.0 L/min и се използва намален дебит на защитен газ от 2.0 L/min.

Тест за потапяне в Tris-буфер

Обработените проби се поставят в отделни пластмасови контейнери със 150 ml 0,05 М Трис-НС1 буфер (Трис (хидроксил) метил-аминометан-НС1) с рН 7,4 при 36,5 ° С (стандарт ISO10993-14). Използвано е съотношение на повърхностната проба към буферния разтвор от 0,015 cm 2/ml. Потопените проби и разтворът се държат при 36,5 ° С при разбъркване. Във всеки от следващите периоди от време се взема по една 6-мл аликвотна част от разтвор: 0,5, 1, 3, 6, 10, 24, 48, 72, 168, 336 и 504 часа. Използвани са контролни проби от само 0,05 М Tris-HCl буфер, за да се отхвърли всяко влияние на тестовия процес в крайните резултати. Освен това за целите на сравнението бяха тествани предшественици 45S5 биоактивни стъклени отливки със същите размери като лазерно обработените проби. Тествани бяха десет копия на всеки различен материал. Всеки разтвор се филтрира през стерилни филтри за отстраняване на твърдите вещества от течността и се центрофугира, за да се осигури отделяне на остатъчното твърдо вещество. Спектроскопски елементарни анализи бяха извършени с индуктивно свързана плазмно-оптична емисионна спектроскопия (ICP-OES, Perkin Elmer Optima 4300 DV). Калибрирането за анализи на Ca, Si, P, Na и K се извършва със стандарти от 10 mg/L със стойности на RSD под 2,0%.

Клетъчна култура

Биологичната ефективност на материала е оценена чрез използване на преостеобластната клетъчна линия MC3T3-E1. Тази клетъчна линия е установена от миши калвария C57BL/6 и е получена от Европейската колекция от клетъчни култури (ECACC, Великобритания). Клетките се култивират в MEM-алфа (Sigma, САЩ), допълнена с 10% фетален говежди серум (FBS; Invitrogen, САЩ) и се поддържат при 37 ° С във влажна атмосфера с 5% CO2. Обработени с лазерна облицовка проби с площ 10 × 10 mm 2 се почистват в ултразвукова баня с етанол и ацетон, последвано от въздушно сушене в ламинарна камера. Впоследствие пробите се автоклавират за 15 минути при 121 ° С.

Инвитро цитотоксичност

Механични свойства

Якостта на натиск се определя чрез смачкване на осем CaP-BG цилиндрични проби (диаметър 8 mm) в сухи условия, като се използва аксиална изпитвателна машина, оборудвана с 50 kN товарна клетка и се прилага скорост на наклона от 0,1 mm/min. Микротвърдостта на Vickers HV0.5 е измерена чрез машина за изпитване на микротвърдост, като се прилага товар от 4.903 N за период от 15 s върху повърхността на биоактивното стъкло и върху напречното сечение на сърцевината на CaP. Жилавост на фрактурата КIC беше оценен, веднага след вдлъбнатина, от добре развитите радиални пукнатини 58. Използвана е стойност от 95 GPa за модула на Young за вътрешното ядро ​​на CaP и 78 GPa за външния слой на биоактивното стъкло.

Допълнителна информация

Как да цитирам тази статия: Comesaña, R. et al. Към интелигентен синтез на импланти: свързваща биокерамика с различна резорбируемост, за да съответства на скоростта на костен растеж. Sci. Представител. 5, 10677; doi: 10.1038/srep10677 (2015).