Растителна протеомика и протеинова структурна биология

Тази статия е част от изследователската тема

Биология на растителните плодове, семената и грудковите тъкани: Важна тема в продоволствената сигурност Вижте всички 21 статии

Редактиран от
Сун Тае Ким

Национален университет Пусан, Южна Корея

Прегледан от
Карла Пинейро

Факултет по науки и технологии, Нов университет в Лисабон, Португалия

Ахмад Арзани

Технически университет Исфахан, Иран

Принадлежностите на редактора и рецензенти са най-новите, предоставени в техните профили за проучване на Loop и може да не отразяват тяхното положение по време на прегледа.

качество

  • Изтеглете статия
    • Изтеглете PDF
    • ReadCube
    • EPUB
    • XML (NLM)
    • Допълнителни
      Материал
  • Цитат за износ
    • EndNote
    • Референтен мениджър
    • Прост ТЕКСТ файл
    • BibTex
СПОДЕЛИ НА

Оригинални изследвания СТАТИЯ

  • 1 Департамент по биологични науки, Институт по информационни технологии COMSATS, Исламабад, Пакистан
  • 2 Катедра по растителни науки, Университет Куейд-и-Азам, Исламабад, Пакистан

АКЦЕНТИ

• Ризобактерии (Азотобактер spp.) са подобрили качеството и количеството протеин от семена на шафран.

• Качеството на протеините беше потвърдено от SDS-PAGE и бяха открити нови ленти в отговор на различни комбинации от ризобактерии и по-ниски дози торове.

• Приложението PGPR е намалило използването на торове до 50%.

Протеините са съществена част от човешката диета. Целта на настоящото проучване е да се подобри качеството на протеините в семената на шафран чрез прилагане на растеж на растенията, стимулиращ ризобактерии (PGPR) в комбинация с конвенционални азотни и фосфатни (NP) торове. Семената на два сорта шафран Thori и Saif-32 бяха инокулирани с Азоспирилум и Азотобактер и се отглежда при полеви условия. Съдържанието и качеството на протеините се оценяват чрез суров протеин, анализ на аминокиселини и SDS-PAGE. Суровият протеин в семената и аминокиселините (метионин, фенилаланин и глутаминова киселина) показват значителни подобрения (55–1250%) от Азотобактер допълнено с четвърт доза торове (BTQ) при P ≤ 0,05. Допълнителни протеинови ленти бяха индуцирани в Thori и Saif-32 от BTQ и BTH (Азотобактер допълнена с половин доза тор) съответно. The Азоспирилум в комбинация с половин доза тор (SPH) и BTQ подобрено съдържание както на индол оцетна киселина (IAA) (90%), така и на гиберелова киселина (GA) (23–27%) в листата на шафран. Взети заедно, тези данни предполагат това Азоспирилум и Азотобактер наред със значително намалената (до 75%) употреба на NP торове може да подобри качеството и количеството протеин от семена на шафран.

Въведение

Маслодайните култури са важни източници на хранителни вещества и могат да служат като важен хранителен източник за задоволяване на хранителните нужди (Escudero et al., 2006; Yeilaghi et al., 2012). Само консумацията на маслени семена и бобови растения може да отговори на търсенето на протеини и мазнини. Подобни практики имат голям потенциал за осигуряване на адекватен прием на хранителни вещества и енергия от бебета и деца в лоши условия, където протеиново-енергийното недохранване (PEM) продължава да възпрепятства оптималния растеж и развитие. С нарастващото глобално търсене на животински продукти е задължително изследването на местно достъпни храни с потенциална употреба като допълнителни източници на протеини и енергия.

Протеините от семената играят важна роля в храненето на човека и храната на животните. При растенията аминокиселините са основният градивен елемент за синтеза на протеини (Lam et al., 1996) и по този начин играят важна роля в човешкото хранене. Фенилаланинът е основна аминокиселина, тъй като е предшественик на много важни метаболитни съединения, а именно фенилпропаноиди. По подобен начин триптофанът е от изключителна важност като предшественик на фитохормони като индол оцетна киселина (IAA). Ето защо е от решаващо значение да подобрим качеството на протеините в семената чрез устойчиви мерки, като например чрез прилагане на растеж на растенията, насърчаващ ризобактерии (PGPR).

PGPR на рода Азоспирилум и Азотобактер са широко разпространени в ризосферата на тропическите и субтропичните растения. Механизмите, чрез които Азоспирилум spp. може да окаже положително влияние върху растежа на растенията вероятно чрез множество реакции, включително промени в синтеза на фитохормони и фиксиране на азот, както и активността на нитрат редуктазата (El-Komy et al., 2003). Предложени са няколко механизма, чрез които те насърчават растежа на растенията. Тези механизми включват производство на фитохормони, стимулиране на усвояването на хранителни вещества, фиксиране на азот, подобряване на наличността на първични хранителни вещества в растението (Wu et al., 2005), производство на ензими, рибофлавин, тиамин и синтез на антибиотици и фунгицидни съединения (Bharathi и др., 2004). Mirzaei et al. (2010) съобщават, че Азоспирилум и Азотобактер инокулацията подобрява съдържанието на протеин в семената в шафран в сравнение с контролите. Babalola (2010) съобщава, че синтезът на аминокиселини е важна характеристика на PGPR и аминокиселините, синтезирани от PGPR, включват глутаминова киселина, лизин, валин, серин, изолевцин и левцин.

Шафранът е широколистна маслодайна култура от семейство Asteraceae, предимно адаптирана към суха земя (Bahrami et al., 2014). Произхожда от Южна Азия и се отглежда в Китай, Индия, Персия, Египет и Пакистан. Използва се като източник на багрило, лекарства и храна. Култивира се като източник на масло и протеини. Съдържа 34% масло и 22–24% протеин, а семената му са богат източник на естествен антиоксидант (токоферол). Брашното от семена от шафран след екстракция на масло се използва като фураж за добитък и органичен тор.

С нарастващия проблем със замърсяването на почвата/околната среда и извличането на хранителни вещества са необходими спешни действия за справяне с глобалната заплаха от замърсяване с азот. Агрономична, биохимична и биомаса информация за добива на шафран в отговор на PGPR и NP торове са публикувани преди това (Nosheen and Bano, 2014). Основната цел на това проучване беше да се сведе до минимум използването на азотни и фосфорни торове чрез допълване на PGPR (Азоспирилум и Азотобактер) за подобряване на протеиновото качество на семената от шафран, което се счита за важна култура от хранителна гледна точка.

Материали и методи

Проведен е полеви експеримент при естествени условия през октомври 2009–2010 и 2010–2011 в областта на Катедрата по растителни науки към университета Куейд-и-Азам. Използва се рандомизиран пълен блок дизайн (RCBD) с три повторения с размер на графиката 1 × 1 m 2. Разстоянието между редовете беше 45 cm. Сертифицирани семена от шафран cv. Тори и cv. Saif-32 е получен от Националния център за научни изследвания в селското стопанство (NARC) в Исламабад. Семената бяха повърхностно стерилизирани преди сеитба с 95% етанол, след това стерилизирани с 10% хлорокс за 3 минути и измити последователно 3-4 пъти с автоклавирана дестилирана вода.

Инокулация на семена

Течни култури от Azospirillum brasilense и Azotobacter vinelandii Khsr1 се отглеждат при 24 ° C в среда Luria-Bertani (LB). PGPR се прилагат като инокулация на семена със скорост 10 6 клетки/ml. За приготвяне на инокулум, 100 ml LB среда бяха инокулирани с 24 h течни култури от A. brasilense (Номер за присъединяване GQ255949) и А. vinelandii Khsr1 (номер за присъединяване GQ849485) и продължи да се разклаща (Excella E24, Ню Брунсуик Научен инкубатор, шейкър серия, Ню Герси, САЩ) в продължение на 72 часа при 124 об/мин при 24 ° C. Течните култури се центрофугират при 2415 ж за 10 минути. Супернатантът се изхвърля и гранулата се разрежда с автоклавирана дестилирана вода до оптична плътност при 600 nm. Стерилизираните семена бяха накиснати в течни култури за 6 часа преди сеитбата.

Прилагане на торове

Използваните торове са азот и фосфор (NP), карбамидът е използван като източник на азотен тор, а DAP (диамониев фосфат) е използван като източник на фосфорен тор. Азотните торове (N) бяха приложени в три дози, т.е. пълна доза карбамид (карбамид 60 Kg ha -1), половината (карбамид 30 Kg ha -1) и четвърти дози (карбамид 15 Kg ha -1). Цялото количество фосфорен тор (P) (пълни 30 kg ha -1, половин 15 Kg ha -1 и четвърт доза 7,5 Kg ha -1) се внася по време на сеитбата, докато карбамидът се прилага на три различни етапа през интервал от 40 d, първата доза е приложена по време на сеитбата.

Благодарение на дълбоката си коренна зона, шафрановите култури могат да получат влага много под повърхността. През сезона бяха приложени 2-3 кръга напояване. Първият напоителен кръг беше осигурен 1–1/2–2 месеца след поникването; второто напояване се случи по време на цъфтежа и последният кръг напояване беше даден по време на развитието на семената. Използвана е система за напояване на повърхността, докато полето се насити.

Бяха приложени следните лечения.

Екстракция и пречистване на фитохормони (IAA и GA)

Екстракцията и пречистването на фитохормоните се извършва по метода на Kettner and Doerffling (1995). Пресни листа (1 g) се събират на вегетативния етап и се смилат в 80% метанол при 4 ° C с бутилиран хидроксил толуен (BHT), използван като антиоксидант. Екстракцията се извършва при 4 ° С до 72 часа на тъмно с последваща смяна на разтворителя на всеки 24 часа. Екстрахираните проби се центрофугират и супернатантата се редуцира до водна фаза с помощта на ротационен изпарител с тънък филм (RFE) при 35 ° С. РН на водната фаза се регулира на 2.5-3.0 с 0.1 N HCI и се разпределя четири пъти с 1/2 обем етилацетат. Етилацетатът се изсушава напълно с помощта на ротационен изпарител с тънък филм. Изсушените проби се разтварят повторно в 1 ml метанол (100%) и се анализират на HPLC (Agilent 1100, Германия), използвайки U.V. детектор и колона C-18 (39 × 300 mm).

За идентифициране на хормони пробите се филтрират през милипорни филтри (0.45 μm) и се инжектират върху колоната. Като подвижна фаза се използват метанол, оцетна киселина и вода (30: 1: 70). Дължините на вълните, използвани за откриване на IAA, са 280 nm (Sarwar et al., 1992), докато за анализ на GA тя е коригирана на 254 nm (Li et al., 1994). Тези хормони на растежа бяха идентифицирани въз основа на времето на задържане и пиковата площ на стандартите. Чистите IAA и GA3 (Sigma Chemicals Co. Ltd., САЩ) са използвани като стандарти за идентификация и количествено определяне на растителните хормони.

Оценка на суровия протеин от семена

Суровият протеин от семена се изчислява по метода на Kjeldahl (AOAC, 2000). Проби от семена (700 mg) се поставят в епруветки за разграждане на Kjeldahl и се добавят 5 g от всеки от K2SO4 и CuSO4, след което към сместа се добавят 25 ml H2SO4. Сместа се смила в продължение на 1 час при 340 ° С. След охлаждане при стайна температура се добавят 20 ml дейонизирана вода и след прибавяне на 40% NaOH (25 ml) се извършва дестилация. Освободеният амоняк се събира в борна киселина и се титрува с НС1 (0,1 N). Приготвената заготовка също се третира по същата процедура. Процентът на суровия протеин се изчислява съгласно следната формула.

Където 14 е молекулно тегло на азота и 5.30 е азотният фактор за протеините от семена на шафран (Mosse, 1990).

Аминокиселинни анализи на семена

Количественият анализ на аминокиселините е извършен по метода на Tkachuk и Irvine (1969). Проби от семена (20 mg) се поставят в епруветки Pyrex и се добавят 4 ml двойно дестилирана солна киселина (6 N) и сместа се замразява при -80 ° C. Хидролизата на пробите се извършва при 110 ° C за различни периоди от време, т.е. 24, 48 и 72 часа във фурна. След това солната киселина се отстранява с помощта на ексикатор, съдържащ гранули от натриев хидроксид. След това се прибавят 25 mL цитратен буфер с нормалност 0.2 и pH 2.2, съдържащ октанова киселина и Brij-35 и неразтворимият хумин се отстранява чрез вакуумно филтруване. Супернатантата (филтратът) се използва за анализ на аминокиселини с помощта на анализатор на аминокиселини. За определяне на аминокиселинните профили на пробите е използван автоматичен анализатор на аминокиселини Hitachi L-8900 (Hitachi High-Technologies Corporation, Токио, Япония) с йонообменна колона 4,6 (ID) × 60 mm. За анализа бяха използвани следните настройки на анализатора: скорост на потока на буфера от 0,4 ml/min, скорост на потока на реагента от 0,35 ml/min, температура на нагревателя на реактора от 135 ° C, температура на колоната от 75 ° C, температура на автоматичното вземане на проби от 5

8 ° C, време на работа от 35,3 (съдържащи сяра аминокиселини) или 56,3 минути (всички други аминокиселини), обем на инжектиране на пробата от 20 μL и дължина на вълната на откриване 570 (пролин) или 440 nm (всички останали аминокиселини). Като разтворители на подвижната фаза се използва протеинов хидролизатен буферен комплект (Kanto Chemical Co., Inc., Токио, Япония) и солна киселина. Стандартна аминокиселинна смес от цистеинова киселина и метионин сулфон (20 μL/ml) се разрежда до 100 μmol/L за количествено определяне и калибриране на аминокиселини. Концентрациите на аминокиселини се отчитат в g ​​/ 100 g.

Статистически анализ

Данните бяха анализирани от софтуера Statistix версия 8.1, като се използва факториен дизайн на дисперсионния анализ (ANOVA) (Таблица 1). Средните стойности са сравнени според Steel и Torrie (1980) с най-малка значима разлика (LSD) при P Ключови думи: шафран, протеин от семена, аминокиселина, оплождане, фитохормони, SDS-PAGE

Цитиране: Nosheen A, Bano A, Yasmin H, Keyani R, Habib R, Shah STA и Naz R (2016) Количество и качество на протеиновите семена от шафран Подобрено от NP Fertilizer и Rhizobacteria (Азоспирилум и Азотобактер spp.). Отпред. Растителна Sci. 7: 104. doi: 10.3389/fpls.2016.00104

Получено: 06 ноември 2015 г .; Приет: 20 януари 2016 г .;
Публикувано: 22 февруари 2016 г.

Сун Тае Ким, Национален университет в Пусан, Южна Корея

Carla Pinheiro, Faculdade de Ciências e Tecnologia da Universidade Nova de Lisboa, Португалия
Ахмад Арзани, Технически университет в Исфахан, Иран