Резюме

Заден план

Синдромът на поликистозните яйчници (PCOS) е сложно ендокринно и метаболитно заболяване с неизвестна патогенеза. Въпреки това, лечението на Diane-35, комбинирано с метформин, може да подобри ендокринната и овулацията на СПКЯ. В това проучване изследвахме ефектите на Diane-35, комбинирани с лечение с метформин (DM), върху овулацията и метаболизма на глюкозата в модел на PCOS плъх.

Методи

Плъховете на Sprague Dawley бяха разделени на 3 групи, контролна група, моделна група (PCOS група) и Diane-35, комбинирани с метформин (PCOS + DM група). Експресионните нива на mRNA се определят чрез qRT-PCR. Нивата на хормоните се определят чрез ензимно-свързан имуносорбентен анализ. Имунооцветяването открива нивата на протеин на лактат дехидрогеназа А (LDH-A), пируват киназа изозим М2 (ПКМ2) и сиртуин 1 (SIRT1) в тъканите на яйчниците. Провежда се анализ на TNUEL за определяне на клетъчната апоптоза при PCOS плъхове. Метаболитите в яйчниковите тъкани се анализират чрез течна хроматография с тандемна мас спектрометрия.

Резултати

PCOS плъховете показват повишено телесно тегло, нива на лутеинизиращ хормон и тестостерон и инсулинова резистентност, което значително се отслабва от лечението на DM. Лечението с DM подобрява нарушения еструсен цикъл и увеличава гранулозните клетки на яйчника при плъховете PCOS. Намалената пролиферация и повишената клетъчна апоптоза на гранулозните клетки в яйчниковите тъкани на PCOS плъхове бяха значително обърнати от лечението с DM. Анализът на метаболизма разкрива, че нивата на АТФ и лактат са значително намалени при плъхове PCOS, което се възстановява чрез лечението с DM. Освен това, експресията на LDH-A, PKM2 и SIRT1 е значително регулирана надолу в яйчниковите тъкани на плъховете PCOS; докато лечението с DM значително повишава експресията на LDH-A, PKM2 и SIRT1 в тъканите на яйчниците на плъховете PCOS.

Заключение

В заключение, нашето проучване демонстрира, че лечението с Diane-35 плюс метформин подобрява патологичните промени в плъховете PCOS. По-нататъшни проучвания показват, че Diane-35 плюс метформин може да подобри енергийния метаболизъм на яйчника чрез регулиране на пътя на гликолиза. Механистичните проучвания показват, че терапевтичните ефекти на лечението с Diane-35 плюс метформин при PCOS плъхове могат да бъдат свързани с регулирането на медиатори, свързани с гликолиза, включително PKM2, LDH-A и SIRT1.

Въведение

Има все повече доказателства, които показват, че разстройството на енергийния метаболизъм на гранулозните клетки е важна причина за анормални фоликули и спад на плодовитостта при жените. Основният енергиен метаболизъм на нормалната фоликулогенеза е, че гранулозните клетки поемат глюкоза от околните тъкани чрез глюкозния транспортер (GLUT) върху техните клетъчни мембрани, след което глюкозата произвежда пировиноградна киселина и млечна киселина по пътя на гликолизата [6, 7]. Голям брой проучвания показват, че пировиноградната и млечната киселина са важни фактори за поддържане на фоликуларния растеж и развитие [8]. Харис и сътр. установи, че фоликулите при пациенти с СПКЯ изискват повече пируват, за да поддържат растежа на фоликулите, отколкото нормалните женски [9]. Резултатите in vitro показват, че стимулирането на тестостерон и инсулин може да намали съдържанието на млечна киселина в гранулозните клетки [10]. Горните проучвания показват, че фоликулите на пациенти с СПКЯ изискват повече пируват и млечна киселина, за да стимулират фоликула да се развива нормално, от една страна, а от друга страна, високият андроген и инсулин намаляват съдържанието на млечна киселина. Въпреки това дали лечението с Diane-35 плюс метформин може да възстанови дисфункцията на енергийния метаболизъм на гранулозните клетки при развитието на PCOS остава неуловимо.

В това проучване ние изследвахме ефектите на Diane-35, комбинирани с лечение с метформин върху овулацията в модел на PCOS плъх. Бяха проведени допълнителни проучвания за определяне на ефектите от комбинираните лечения върху енергийния метаболизъм в яйчниците. В допълнение, ензимите, ограничаващи скоростта на яйчниковата гликолиза и експресията на сиртуин 1 (SIRT1) бяха определени, за да изяснят механистичните действия на комбинираното лечение при възстановяване на дисфункцията на енергийния метаболизъм в PCOS яйчника. Настоящото проучване може да даде нова представа за разбирането на механистичните действия, залегнали в основата на терапевтичните ефекти на Diane-35, комбинирани с лечение с метформин върху СПКЯ.

Материали и методи

Животни и лечение

Общо 40 женски плъхове Sprague Dawley (SD) (на 5 седмици и 130–140 g) са закупени от Лабораторния център за животни на Третия военномедицински университет (Чунцин, Китай). Животните бяха разделени на случаен принцип в контролна група (10 животни) и PCOS група (30 животни). Групата PCOS беше интрагастрално приложение с летрозол [11] (Фармацевтична фабрика Heng Rui, Lianyungang, Jiangsu, Китай), разтворена в 1% (w/w) CMC и хранена с диета с високо съдържание на мазнини. Вагинално намазване на SD плъхове се наблюдава след 1 седмица на моделиране и установяването на модела беше предварително оценено като успешно или не в съответствие с естрозния цикъл. Два плъха с успешен първоначален модел бяха избрани на случаен принцип за морфология на яйчниците и анализ на серумния репродуктивен хормон за проверка. Разделихме SD плъхове, успешно моделирани на PCOS група (10 животни) и PCOS + Diane-35 плюс метформин (DM) група (10 животни). Групата PCOS + DM се третира, както следва: Diane-35 и метформин са интрагастрално приложение на SD плъхове до 21 дни. Групата PCOS беше напоена с 1% CMC до 21 дни. Всички експерименти с животни са одобрени от Комитета по етика на животните към Първа свързана болница на Медицинския университет в Гуилин (No.GLMC202003153).

Вагинална цитология

Направени са вагинални цитонамазки съответно в продължение на 14 дни преди края на моделирането и лечението. Накратко, вагината се промива с 35 μL физиологичен разтвор (0.9% NaCl) за 2-3 пъти. Вагиналната течност (10–20 μL) се събира върху предметното стъкло. След изсъхване на въздух при стайна температура, предметните стъкла се фиксират с метанол, последвано от оцветяване с Wright’s – Gimsa (Solarbio, Пекин, Китай) съгласно протокола на производителя. Промените на вагиналните епителни клетки се оценяват под светлинен микроскоп, за да се определи еструсният цикъл.

Събиране на серум и измерване на хормонални нива

В края на експеримента плъховете се упояват чрез интраперитонеално инжектиране на 10% хлоралхидрат (0,2 ml/100 g). Кръв се събира чрез сърдечна пункция и серумът се изолира чрез центрофугиране при 2500 rpm в продължение на 20 минути. Серумните нива на тестостерон и LH се определят чрез съответните търговски комплекти за имуносорбентен анализ (Abcam, Cambridge, USA).

Морфологичен анализ на яйчника

Яйчниковите тъкани се дисектират и фиксират в 4% параформалдехид за една нощ при 4 ° С, вграждат се в парафин, разделят се на филийки с дебелина 5 μm, депарафинизират се и се оцветяват с хематоксилин и еозин. Морфологията на яйчниковите тъкани беше оценена под светлинен микроскоп.

Имунохистохимичен анализ на пролифериращ клетъчен ядрен антиген (PCNA), лактат дехидрогеназа a (LDH-A), пируват киназа изозим M2 (PKM2) и SIRT1

Яйчниците бяха фиксирани в 4% формалдехид и вградени в парафин; Резените с дебелина 5 μm бяха разделени. Секциите бяха проникнати с 1% Triton X-100 във фосфатно буфериран физиологичен разтвор (PBS) в продължение на 30 минути при стайна температура, варени в 100 mM натриев цитрат (рН 6.0) три пъти в продължение на 6 минути всеки на интервали от 5 минути за извличане на антиген, и след това се инкубира с 3% водороден пероксид в продължение на 30 минути за отстраняване на ендогенна пероксидаза, последвано от блокиране в 5% говежди серумен албумин при стайна температура за 1 h. След това срезовете бяха инкубирани една нощ при 4 ° С с първични кози поликлонални PCNA, LDH-A, PKM2 и SIRT1 антитела в блокиращия разтвор. След три измивания с 0,1% Tween-20 в PBS, пробите се инкубират със заешко анти-козе биотин-SP-конюгирано антитяло (1: 100; SA00004-4, Protein Tech Group Inc.) в блокиращия разтвор при стайна температура за 45 мин. Оцветените PCNA, LDH-A, PKM2 и SIRT1 протеини бяха визуализирани с помощта на 3,3-диаминобензидин хромоген. Първичното антитяло, заменено с нормален кози IgG, се използва като отрицателна контрола. Оцветените срезове бяха оценени под светлинен микроскоп.

Анализ на dUTP никетиран край (TUNEL), медииран от деоксинуклеотидил трансфераза, медииран от терминал

Откриването на апоптотичните клетки в гранулираните клетки на яйчниците се определя чрез анализ TUNEL (Roche Diagnostic Systems, Branchburg, USA), следвайки инструкциите на производителя с модификации [12]. Накратко, срезите бяха обезпарафинирани и рехидратирани във вода и след това третирани с протеиназа К и 3% водороден пероксид, последвано от инкубиране с реакционната смес TUNEL в овлажнена камера при 37 ° С. След това срезовете бяха инкубирани с конюгирано с пероксидаза анти-биотин антитяло. Апоптотичните клетки се визуализират с помощта на 3,3-диаминобензидин хромоген. Хематоксилинът се използва като оцветяване.

Количествена PCR в реално време (qPCR)

Извличането на РНК от тъканите се извършва с помощта на реагент TRIzol (Takara, Dalian, Китай). Синтезът на cDNA беше извършен с помощта на TransScript II едностепенно премахване на gDNA и cDNA Synthesis SuperMix (Transgen Biotech, Пекин, Китай) съгласно протокола на производителя. PCR анализи в реално време за нивото на генна експресия се извършват на Applied Biosystems 7500 PCR система в реално време (Applied Biosystems, Фостър Сити, Калифорния, САЩ). GAPDH беше използван като референтен контрол и нивата на генна експресия бяха изчислени, използвайки сравнителен Ct метод. Последователностите на праймерите са показани в Таблица 1.

Течна хроматография с тандемна масспектрометрия (LC-MS/MS) анализ на яйчниковите метаболити

Статистически анализ

Данните бяха анализирани с помощта на софтуера SPSS 18.0 (SPSS, Inc., Чикаго, IL, САЩ). Експерименталните данни са представени като средно ± стандартно отклонение. Несдвоеният t-тест на Student беше използван за анализиране на сравнението между двете групи. Еднопосочен ANOVA, последван от множество тестове за сравнение на Bonferroni, беше използван за сравнение между множество групи. A P стойност по-малка от 0,05 се счита, че показва статистически значим резултат.

Резултати

Ефект от лечението на DM върху телесното тегло, нивото на хормоните, естростния цикъл и морфологията на яйчниците при PCOS плъхове

Няма значителна разлика в телесното тегло преди индуциране на СПКЯ (фиг. 1а). След индуцирането на PCOS при плъховете, телесното тегло в групата на PCOS се увеличи значително (Фиг. 1b). Лечението с DM значително намалява наддаването на тегло, индуцирано от PCOS (фиг. 1в). В допълнение, нивата на лутеинизиращ хормон и тестостерон и HOMA-IR бяха значително увеличени при PCOS плъховете, което беше значително отслабено от лечението с DM (Фиг. 1d-f).

комбинираното

Ефекти от лечението на DM върху експресията на PCNA и експресията на медиатори, свързани с апоптозата, в яйчника на плъхове на PCOS

Ефекти на DM върху производството на енергийния метаболизъм в яйчниците

Енергийните метаболити на яйчниците се измерват чрез мониторинг с много отговор Нивата на лактат, производството на пуринов метаболизъм и производството на окислително фосфорилиране в яйчника на PCOS + DM групата са значително увеличени в сравнение с PCOS и контролната група, както е показано в топлинната карта (Фиг. 3а), което предполага, че комбинираната терапия може да подобри фоликуларно снабдяване с енергия при PCOS плъхове Нивото на ATP в PCOS групата е значително по-ниско от това в контролната и PCOS + DM група (Фиг. 3b). В допълнение, лечението с DM може значително да увеличи съдържанието на ATP в яйчниците на PCOS плъхове (Фиг. 3b). Лактатът в PCOS групата е по-висок от този в контролната група и лечението с DM значително намалява нивата на лактат в PCOS плъхове (Фиг. 3b). Що се отнася до промените на NAD +/NADH, няма значителна разлика между три групи (фиг. 3б).

Ефекти от лечението на DM върху метаболитните медиатори в яйчниковите тъкани на PCOS плъхове. а Ефекти от лечението на DM върху метаболитните медиатори в яйчниковите тъкани на PCOS плъхове чрез използване на целевия метаболомичен анализ. б Ефекти от лечението на DM върху нивата на ATP, лактат и NAD +/NADH в овариалните тъкани на плъхове PCOS след различни лечения. N = 6

Ефекти от лечението на DM върху ензимите, ограничаващи скоростта на яйчниковата гликолиза и експресията на SIRT1

Дискусия

Diane-35 е съставен от 2 mg ципротерон ацетат и 35 μg етинил естрадиол, който се използва широко за лечение на пациенти с СПКЯ с хиперандрогения [15]. Той действа чрез блокиране на ефектите на андрогени като тестостерон и чрез активиране на прогестероновия рецептор. Функцията на метформин обикновено се описва за модулация на инсулиновата чувствителност и метаболизма на глюкозата при жените от СПКЯ [16]. Комбинацията от лечение с Diane-35 и метформин може да намали нивата на BMI и LU, да подобри състоянието на хиперандрогенемия и инсулинова резистентност при пациенти с PCOS [5]. При индуцираните от дихидротестостерон плъхове PCOS Diane-35 е установено, че е ефективен за възстановяване на репродуктивните функции [17]. Последователно в настоящото проучване установихме, че комбинацията от лечение с Diane-35 и метформин намалява телесното тегло, намалява нивата на тестостерон и лутеинизиращ хормон и инсулинова резистентност, а също така възстановява естростния цикъл и овулацията при плъховете PCOS, което показва, че комбинираното лечение подобрява PCOS усложненията.

Настоящото проучване за първи път демонстрира благоприятните ефекти от лечението с Diane-35 плюс метформин при плъхове PCOS и по-важното е, че механистичните проучвания разкриват, че няколко ключови медиатора, свързани с гликолизата и енергийния метаболизъм, могат да бъдат модулирани от Diane-35 plus metformin лечение. Разследването обаче все още се ограничава до предварителния му етап и следващите функционални изследвания на тези медиатори в бъдещи проучвания трябва да бъдат проучени. Тъй като Diane-35 и метформин са били предложени за лечение на СПКЯ, могат да се проведат допълнителни клинични проучвания, за да се определи експресията на тези ключови медиатори при пациенти с СПКЯ след лечението и да се оцени клиничното значение на тези медиатори.

Заключения

В заключение, нашето проучване демонстрира, че лечението с Diane-35 плюс метформин подобрява патологичните промени в плъховете PCOS. По-нататъшни проучвания показват, че Diane-35 плюс метформин може да подобри енергийния метаболизъм на яйчника чрез регулиране на пътя на гликолиза. Механистичните проучвания показват, че терапевтичните ефекти на лечението с Diane-35 плюс метформин при PCOS плъхове могат да бъдат свързани с регулирането на медиатори, свързани с гликолиза (PKM2 и LDH-A) и SIRT1. Необходими са бъдещи проучвания за определяне на биологичната функция на медиаторите, свързани с гликолизата при пациенти с PCOS.