РЕЗЮМЕ

ВЪВЕДЕНИЕ

Морските водорасли са богати на биоактивни съединения, като протеини, пептиди, аминокиселини, липиди, фибри, пигменти, полифеноли и полизахариди (1, 2), които са отговорни за придаването на различни ползи за здравето. Например, β-каротинът и лутеинът са идентифицирани като антимутагенни вещества в годни за консумация червени водорасли, което показва тяхната потенциална противоракова активност (3). Освен това, проучвания върху мишки/плъхове и хора показват, че хранителните добавки с различни екстракти от различни водорасли корелират с намален риск от рак на гърдата (4, 5). Полизахаридите, протеините, пептидите и аминокиселините от редица морски водорасли показват благоприятна активност срещу диабет, рак, СПИН и съдови заболявания (2). Червените водорасли Chondrus crispus (Rhodophyta) са широко разпространени в северната част на Атлантическия океан. Представената тук работа беше извършена с помощта на патентован щам C. crispus, който се култивира на земя в Нова Скотия, Канада, за азиатския пазар на храни от Acadian Seaplants Limited. Освен високото съдържание на общи протеини, олигопептиди и пигменти, това червено водорасло е богато на водоразтворимия полизахарид карагенан (CGN) (6), за който се съобщава, че има антивирусен (7, 8) и противотуморен (9, 10) дейности.

култивираните

CGN са линейни полимери на дигалактозни остатъци и могат да бъдат извлечени от някои видове червени водорасли. CGN се използват широко в хранителната промишленост като сгъстители, стабилизатори и емулгатори. C. crispus произвежда три вида CGN на различни етапи от жизнения си цикъл. В диплоидната фаза на спорофит той произвежда ламбда-CGN, докато хаплоидният гаметофит произвежда предимно капа-CGN (K-CGN) с малко йота-CGN. Гаметофитът също така произвежда предшествениците на kappa- и iota-CGNs, mu- и nu-CGNs. Mu- и nu-CGN са по-сулфатирани от типовете kappa- и iota-CGN и са в нежелани форми. Тези прекурсори са по-подобни на ламбда-CGN по отношение на нивата на сулфатиране и свойствата на разтворимост (J. S. Craigie, лична комуникация). Водният екстракт, използван в настоящата работа, съдържа множество съединения, като K-CGN е основният тип CGN.

Имунният отговор на C. elegans към P. aeruginosa се медиира чрез p38 активирана от митоген протеин киназа (PMK-1), трансформиращ растежен фактор β (TGF-β) и DAF-2/DAF-16 инсулиноподобни и ZIP-2 пътеки (17–20). Наскоро беше демонстриран екстракт от кафяви водорасли Ascophyllum nodosum, който предпазва C. elegans от инфекция от P. aeruginosa щам PA14 (21). В настоящото проучване тествахме ефектите на водния екстракт от култивираните червени водорасли C. crispus върху имунитета на гостоприемника и патогенността на PA14, използвайки модела на C. elegans инфекция с PA14. Освен това изследвахме ефекта на чист K-CGN, преобладаващият водоразтворим полизахарид, присъстващ в C. crispus, върху имунитета на гостоприемника. Нещо повече, ние използвахме редица мутантни линии на C. elegans, за да определим ролята на различни сигнални пътища в имунния отговор, предизвикан от K-CGN.

МАТЕРИАЛИ И МЕТОДИ

Приготвяне на екстракти от морски водорасли. Култивираният на сушата патентован щам на C. crispus, използван в това проучване, е получен от Acadian Seaplants Limited (Dartmouth, NS, Канада). Изсушените водорасли (250 g) се екстрахират с вода (два пъти по 1,5 литра всеки път) чрез обработка с ултразвук за 1 h при стайна температура. Водната фракция се концентрира при понижено налягане и се суши лиофилно за една нощ, давайки воден екстракт (CCWE; 67.1 g). CCWE се съхранява при -20 ° C. Прахът K-CGN с изследователска степен е получен от Cargill Texturant Systems, Франция. Основен разтвор на CCWE или K-CGN се приготвя чрез разтваряне на праха в дестилирана вода до концентрация съответно 25 mg/ml или 10 mg/ml и се съхранява при 4 ° С. Основните разтвори се приготвят не повече от 1 седмица преди употреба, за да се избегне разграждането на биоактивни съединения поради продължително съхранение.

Бактериален щам и култура. Клиничният изолат на P. aeruginosa, щам PA14, беше любезен подарък от Eric Déziel (INRS, Institute Armand-Frappier-Microbiologieet Biotechnologie, Laval, QC, Канада). PA14 се култивира и поддържа в среда на King's B (KB) или върху KB среда агар, освен ако не е посочено друго. Бактериалните запаси PA14, съхранявани при -80 ° C, се размразяват и култивират в 3 ml KB среда при 37 ° C в продължение на 6 h при постоянно разклащане, последвано от нанасяне на културата върху плата с KB агар. Плаката се инкубира при 37 ° С за една нощ и след това се отделя единична колония от KB агаровата плочка, инокулира се в 10 ml KB среда и се култивира една нощ при 37 ° С с постоянно внимателно разклащане (150 rpm). Културата се разрежда до оптична плътност при 600 nm (OD600) от 1,0 със свежа KB среда, съхранява се при 4 ° C и се използва в рамките на 1 седмица.

Анализ на обща протеаза. PA14 се култивира в присъствие (третиране) или отсъствие (контрол) на 500 μg/ml CCWE и протеазната активност се определя спектрофотометрично при 600 nm чрез измерване на ефикасността на хидролизата на обезмасленото мляко на протеазата, секретирана в културата. Протеазната активност се изразява като mg протеин, хидролизиран на ml култура на час, като се използва стандартна крива, генерирана от серийно разреждане на обезмаслено мляко (обезмаслено мляко на прах за микробиология; BDH) (23).

Анализ на алкална протеаза. Алкалната протеазна активност на супернатантата на PA14, култивирана в присъствие (третиране) или отсъствие (контрол) на 500 μg/ml CCWE, беше изследвана с помощта на брилянтен син влакнест прах Hide-Remazol (Sigma). Алкалната протеазна активност се изразява като единици, където 1 единица се определя като увеличение от 1,0 на OD595 на ml на час (24).

Анализ на еластазата. Еластазната активност на PA14, култивирана в присъствие (третиране) или отсъствие (контрол) на 500 μg/ml CCWE, се определя с помощта на еластин-конго червен прах (Sigma). Еластазната активност се изразява като увеличение на OD495 на ml PA14 филтрат (25).

HCN анализ. Производството на циановодород (HCN) чрез PA14 в присъствието (третиране) или отсъствието (контрол) на 500 μg/ml CCWE се визуализира чрез променящия се цвят на натриев пикрат поради редукционната активност на HCN (26). Дисковете за филтърна хартия бяха наситени с натриев пикрат и прикрепени към долната страна на капака на плочите за култивиране, които бяха засяти с PA14. Плаките бяха запечатани и инкубирани преди елуиране и кафявожълтото съединение на дисковете беше спектрофотометрично количествено определено. Количеството на съответния HCN се изразява като OD625 (27).

Анализ на пиоцианин. Пиоцианинът в 3 ml филтрат на PA14, култивиран в присъствието или отсъствието на 500 μg/ml CCWE, се екстрахира с хлороформ-HCl и се определя количествено чрез определяне на абсорбцията при 520 nm, както е описано по-рано (28), с малки модификации.

Сидерофорен анализ. Сидерофорът PA14 в 20-милилитров филтрат за култура с (третиране) или без (контрол) 500 μg/ml CCWE се екстрахира в етилацетат, изсушава се с азотен изпарител (N-EVAP; Efamol Research Inc., Канада), разтворен в етанол, смесен с реагента на Hathway и подложен на отчитане на абсорбцията при 700 nm. Количеството сидерофор се изразява като OD700 на културалния филтрат (29).

Анализ на биофилм с микротитърна плоча. Относителното количество биофилм беше определено чрез отчитане на OD590 на четец на микроплаки (BioTek) (30). Биофилмът PA14, който се образува в присъствието (третиране) или отсъствието (контрол) на 500 μg/ml CCWE, се оцветява с кристално виолетово и се измива, след което се определя абсорбцията на конюгираното с етанол биофилм петно. Количеството биофилм се изразява като OD590 на ml от филтрата.

Индуцирано от CCWE и K-CGN оцеляване на червеи от див тип C. elegans срещу инфекция с P. aeruginosa PA14. Тествани са различни концентрации на CCWE и K-CGN в сравнение с отрицателна контрола (вода). Ден 1 възрастни N2 червеи, отгледани с CCWE или K-CGN като хранителна добавка, са били изложени на PA14 бактериална тревна площ, която е установена в присъствието на CCWE или K-CGN. Данните са представени като средната стойност ± SD. Вижте таблица 1 за статистически данни.

CCWE/K-CGN защитава див тип C. elegans срещу инфекция с P. aeruginosa PA14

Компонентите на CCWE са изследвани за ефекта им върху индуцирането на имунитета на гостоприемника. Въз основа на съобщените по-рано имуномодулиращи ефекти на CGN и факта, че CGN представлява 40% от теглото на нашия CCWE препарат (31), ние разсъдихме, че преобладаващият водоразтворим полизахарид в CCWE, K-CGN, може да има изигра роля в наблюдаваната защита на C. elegans срещу PA14 инфекция. Следователно, ефектът на чист K-CGN беше тестван, използвайки модела на C. elegans инфекция. Чистотата на пробата K-CGN, използвана в настоящата работа, беше потвърдена чрез протонно ядрено-магнитен резонанс на спектрометър Bruker 700-MHz (виж фиг. S2 в допълнителния материал). За да съответства на оптималната концентрация на CCWE, бяха използвани 200 μg/ml K-CGN. Наблюдаваните защитни ефекти на K-CGN са подобни на ефектите, наблюдавани по-рано при CCWE (фиг. 1 и таблица 1), особено през периода от 24 часа до 96 часа, с 20% степен на защита при 120 часа (P C. elegans при неинфекционни условия и предполага потенциален ефект на имунна модулация в отговор на PA14 инфекция.

Сигналните пътища daf-2/daf-16, pmk-1 и skn-1 са от съществено значение за K-CGN-индуцираната защита срещу PA14 инфекция. Мутанти с една от четирите мутации на загуба на функция, т.е. мутанти, които са дефектни в един от пътищата на имунен отговор daf-2, daf-16, pmk-1 или skn-1, бяха тествани, за да се изследва кой имунен път е важно за K-CGN-индуцираната защита срещу летална инфекция с PA14. Както е показано на фиг. 2, лечението с K-CGN не е защитило нито един от мутантите, докато е защитило N2 червеи, което предполага, че функционалните daf-2, daf-16, pmk-1 и skn-1 са от съществено значение за K- CGN-медииран имунитет срещу PA14.

K-CGN-индуцираната преживяемост е нарушена при мутанти daf-16, daf-2, pmk-1 и skn-1. K-CGN е допълнен с хранителния източник на червеи от ранен стадий на L1 до зряла възраст. След това ден 1 възрастни червеи бяха прехвърлени в бактериална трева на P. aeruginosa PA14, която беше предварително установена в присъствието на K-CGN. Червеите, отгледани без добавка K-CGN, изложени на поляна PA14, установена в отсъствието на K-CGN, служат за контрол. Р е> 0,05 за всеки мутант спрямо същия мутант плюс K-CGN. Данните са представени като средната стойност ± SD.

Биохимични тестове на PA14-секретирани фактори на вирулентност. (A) Ефект на CCWE върху общата протеазна активност на PA14; (B) ефект на CCWE върху алкалната протеазна активност на PA14; (C) ефект на CCWE върху еластазната активност на PA14; (D) ефект на CCWE върху производството на HCN в PA14; (E) ефект на CCWE върху производството на пиоцианин в PA14; (F) ефект на CCWE върху производството на сидерофори в PA14. Контрол, не е добавен CCWE към културата PA14; CCWE, PA14 се култивира с CCWE. Експериментите са проведени с три биологични повторения и три технически повторения. Данните са представени като средната стойност ± SD. P стойности, 0,001, 0,07, CCWE инхибира образуването на биофилм на PA14. Наличието на биофилми влияе върху патогенността на PA14. Ефектът на CCWE върху образуването на биофилм е изследван чрез оцветяване с кристално виолетово. Когато 500 μg/ml CCWE присъства в хранителната среда, PA14 образува 0,09 единица биофилм, което е 3-кратно намаление в сравнение с 0,29 единица, образувана от контролата (P = 0,001).

ДИСКУСИЯ

Клиничният изолат P. aeruginosa PA14 е патогенен както за Arabidopsis thaliana, така и за силно изгорени мишки, като в последния случай инфекцията с PA14 е летална (34). Патогенността както в растителния, така и в животинския модел се медиира от редица фактори на вирулентност, включително toxA, plcS и gacA. Интересното е, че PA14 и друг щам на P. aeruginosa, PAO1, демонстрират, че убиват почвената нематода C. elegans за часове или дни, в зависимост от вида на растежната среда, използвана в теста за убиване (12, 35). В настоящото проучване използвахме модела на C. elegans инфекция, за да изследваме ефектите на воден екстракт от търговски култивиран щам на червените водорасли C. crispus както върху имунитета на гостоприемника, така и върху патогенността на P. aeruginosa. Забелязахме, че 500 μg/ml CCWE упражнява най-добрата защита срещу PA14 убиване за червеите, докато по-високите или по-ниските концентрации са по-малко ефективни. Този резултат беше в съответствие с това, което по-рано беше наблюдавано за екстракт от търговски събрани кафяви водорасли, A. nodosum, в подобна моделна система (21).

Процъфтявайки в крайбрежните води, водораслите са развили здрави защитни механизми, например инхибиране на QS срещу патогени, като повсеместната бактерия P. aeruginosa. Поразително е, че CCWE представи свойства като инхибитор на QS в патогенния щам PA14, което предполага, че червените водорасли C. crispus per se могат да бъдат от полза за приложения, по-широки от само функционална храна. В анализите на кривата на растеж CCWE и неговият основен компонент, K-CGN, не премахват растежа на PA14 (виж фиг. S6 в допълнителния материал). В съответствие с това, при тест за дифузия на диска, CCWE не показа пряка антимикробна активност (вж. Фиг. S7 в допълнителния материал). CCWE обаче репресира експресията на PA14 QS гени и намалява нивата на секретирани фактори на вирулентност PA14, без да засяга неговите гени за домакинство (Фиг. 4 и 5). Интересното е, че в друго проучване, което изследва 30 вида зелени, кафяви и червени водорасли, инхибиторите, усещащи кворум, са показани само в червените водорасли Asparagopsis taxiformis (36); друг вид червени водорасли, Delisea pulchra, е първото водорасло, за което се съобщава, че съдържа съединения с анти-QS активност (37).

Друг аспект на модела на C. elegans инфекция е, че крайната точка на PA14 убито за контролните червеи N2 е не по-рано от 120 h след експозиция, което е по-късно от описаното в предишни доклади (12, 38). Обяснение за по-бавното убийство може да бъде използването на FUdR в настоящото проучване. FUdR блокира етапа на средно разпространение на ембрионалното развитие на C. elegans (39), като по този начин предотвратява излюпването на яйца, което помага да се избегнат объркващите ефекти от производството на потомство. Доказано е, че потискането на имунитета при C. elegans е свързано с репродукцията или, по-точно, с нормалното ембрионално развитие. Съобщава се, че стерилните мутанти на C. elegans, когато са поставени в условия на инфекция с PA14, оцеляват по-дълго от червеи от див тип N2 и в съответствие с това, третирани с FUdR червеи също оцеляват по-дълго (38).

Забележително е, че в настоящата ни работа избраните имунни гени се регулират от поне четири различни сигнални пътища. Например, гените за отговор на инфекцията irg-1 и irg-2 са медиирани от zip-2 пътя, докато ShK-подобен секретиран повърхностен протеин F49F1.6 и С-тип лектин F56D6.2 се регулират от PMK- 1 път (20). Освен това лизозимоподобният протеин Lys-1 се регулира както от сигналните пътища на TGF-β, така и от PMK-1, докато CUB-подобният протеин K08D8.5 е под регулацията както на PMK-1, така и на DAF-2/DAF- 16 инсулиноподобни пътеки (43). Освен това се смята, че подобен на сапсонин протеин Spp-1 се регулира от пътя DAF-2/DAF-16, заедно с все още неизвестен път (33). По този начин, регулирането на гените на имунния отговор чрез различни известни и все още неизвестни сигнални пътища може допълнително да отчете диференциалната експресия на гените на имунния отговор.