Интегративна физиология, Катедра по молекулярна медицина и хирургия, Karolinska Institutet, Стокхолм, Швеция

Интегративна физиология, Катедра по физиология и фармакология, Karolinska Institutet, Стокхолм, Швеция

Интегративна физиология, Катедра по молекулярна медицина и хирургия, Karolinska Institutet, Стокхолм, Швеция

Интегративна физиология, Катедра по молекулярна медицина и хирургия, Karolinska Institutet, Стокхолм, Швеция

Интегративна физиология, Катедра по физиология и фармакология, Karolinska Institutet, Стокхолм, Швеция

Отделение по хирургия, Катедра по клинични науки, болница Danderyd, Karolinska Institutet, Стокхолм, Швеция

Адрес за заявки за повторно отпечатване и друга кореспонденция: E. Näslund, Катедра по клинични науки, болница Danderyd, Karolinska Institutet, 182 88 Стокхолм, Швеция (имейл: [имейл защитен]).

Резюме

Затлъстяването се определя от индекс на телесна маса (ИТМ) по-голям от 30 kg/m 2 и резултат от прекомерен прием на калории пропорционално на енергийните разходи. Затлъстяването е нарастваща епидемия; следователно това заболяване поставя голяма тежест върху здравните системи в световен мащаб (27). Рискът от диабет тип 2, исхемична болест на сърцето и няколко вида рак е по-голям при възрастни със затлъстяване (27). Освен това повишената заболеваемост и смъртност, свързани със затлъстяването и свързаните с него заболявания, представляват голяма икономическа, медицинска и социална тежест в повечето страни (27). Предвид бремето на болестта и разходите за здраве, свързани с нарастващото разпространение на затлъстяването, са необходими усилия за идентифициране на основната патофизиология и трайни лечебни методи.

Инсулиновата резистентност при диабет тип 2 и затлъстяване е придружена от нарушено усвояване на глюкоза в скелетните мускули и дисфункция на адипоцитите. В идеалния случай, по време на състояния на излишък от хранителни вещества, мастната тъкан поема и съхранява липиди. Въпреки това, когато мастната тъкан е наситена, както при затлъстяването, излишните липиди също могат да се съхраняват като извънматочна мазнина в черния дроб и скелетните мускули (12). Ектопичното съхранение на мазнини в скелетните мускули е придружено от нарушено действие на инсулина върху метаболизма на глюкозата (19, 28). Въпреки че повишеното общо вътремиоцелуларно съдържание на липиди допринася за инсулиновата резистентност на скелетните мускули, тренираните за издръжливост, чувствителни към инсулин спортисти също имат повишено вътремиоцелуларно съдържание на липиди (8). Освен това количеството, местоположението и оборотът на специфични липидни видове също влияят върху инсулиновата чувствителност (8). Модалностите за намаляване на извънматочната мастна тъкан, включително тренировки за упражнения и диетична интервенция, подобряват чувствителността към инсулин, но основните молекулярни механизми и специфичните липидни видове, които са модулирани в отговор на тези смущения при затлъстели възрастни, са неизвестни.

Краткосрочната нискокалорична диета е ефективна стратегия за предизвикване на значителна загуба на тегло и подобряване на инсулиновата чувствителност при затлъстели възрастни (14, 18, 23). Нискокалоричната диетична интервенция намалява интрамускулното съдържание на триглицериди и диацилглицерол, едновременно с подобрена чувствителност към инсулин (11, 21). По този начин ние предположихме, че подобрения в инсулиновата чувствителност след загуба на тегло от краткосрочни диетични интервенции с промени в експресията на метаболитни гени и изобилие от специфични липидни видове. Проведохме безпристрастна генна експресия, за да изясним генните мрежи на скелетните мускули, участващи в метаболитните адаптации към загуба на тегло и целенасочен липидомичен анализ на скелетните мускули, за да изследваме промените в липидния състав след загуба на тегло.

Открихме, че експресията на иРНК на гени, участващи в транспорта или метаболизма на мастните киселини, включително дълговерижен транспортер на мастни киселиниSLC27A1 или FATP1), митохондриалната малонил-КоА декарбоксилаза (MLYCD) и пируват дехидрогеназа киназа 4 (PDK4), беше увеличен; стеароил-КоА десатураза-1 (SCD1) беше намален; и митохондриална функция гени пероксизомен пролифератор активиран рецептор γ коактиватор 1-α (PGC1α) и митохондриален транскрипционен фактор А (TFAM) бяха непроменени. Освен това, краткосрочната диетична намеса намалява специфични видове фосфатидилхолин и триглицериди в скелетната мускулатура, съпътстващи подобрения в клиничните резултати и повишена чувствителност към инсулин.

Участници и диетична интервенция.

Мускулни биопсии и биохимичен анализ.

Участниците се представиха в клиниката сутрин след пост през нощта преди и след диетичната интервенция. Участниците бяха инструктирани да се въздържат от физически упражнения 48 часа преди посещението. Взети са антропометрични измервания и са взети кръвни проби за анализ на клинична химия. След прилагане на локална анестезия (10 mg/ml мепивакаин хидрохлорид, AstraZeneca) са получени биопсии на скелетните мускули с конхотомен инструмент на Weil-Blakesley (Agnthos, Швеция) от vastus lateralis. Биопсиите се изчистват от всякакви видими мазнини, съединителна тъкан или кръвоносни съдове и незабавно се замразяват в течен азот и се съхраняват при -80 ° C до анализ.

Извличане и анализ на РНК.

Общата РНК беше извлечена от биопсии на скелетните мускули, използвайки комплект за екстракция на mRNA на mirVana в съответствие с препоръките на производителя (Thermo Fisher Scientific, Waltman, MA). Концентрацията на РНК се определя спектрофотометрично, като се използва NanoDrop 1000 (Thermo Fisher Scientific). РНК се транскрибира обратно, като се използва комплект за обратна транскрипция на cDNA с висок капацитет (Thermo Fisher Scientific) и qPCR се извършва на система StepOne Plus, използвайки TaqMan Fast Universal PCR Master Mix и специфични сонди TaqMan (Thermo Fisher Scientific). Стойностите на праговия цикъл (Ct) бяха определени със софтуера StepOne (версия 2.3) и относителната генна експресия беше нормализирана чрез геометричната средна стойност на глицералдехид 3-фосфат дехидрогеназата (GAPDH) и актин-β (ACTB), изчислено по сравнителния метод ΔΔCt. Списък на сондите, използвани за анализ на иРНК, е даден в Допълнителна таблица S1, достъпна в добавката за данни онлайн на Американски вестник по физиология Ендокринология и Уебсайт за метаболизъм.

Анализ на микрочипове на генна експресия.

Качеството на РНК се оценява с помощта на експериментални автоматизирани системи за електрофореза (Bio-Rad Laboratories). Пробите от РНК се подлагат на анализ на генни микрочипове, като се използва човешки ген 2.1 ST масив (Affymetrix). Анализът беше извършен в Основното съоръжение за биоинформатика и анализ на експресията в Karolinska Institutet (Huddinge, Швеция). Наборът от данни се депозира в Gene Expression Omnibus (GEO номер за присъединяване: GSE103682).

Липидомичен анализ.

Липидите бяха извлечени от скелетните мускули (

10 mg) и подложени на ултрабърза течна хроматография-базирана на масова спектрометрия липидомичен анализ в Шведския център по метаболомика (Шведски университет по земеделски науки, Умео, Швеция), както е описано по-рано (2). Анализираните липидни класове са триглицерид (TG), диацилглицерид (DG), фосфатидилхолин (PC), сфингомиелин (SM), керамид (Cer), фосфатидилетанол (PE) и фосфатидилинозитол (PI). В процеса на екстракция бяха включени вътрешни стандартни контроли за контрол на ефективността на извличане и варирането в обема на инжектиране. Суровите данни за липидния спектрален брой бяха нормализирани спрямо теглото на биопсията на скелетната мускулатура.

Статистически анализ.

Фиг. 1.Ефект на 3-седмична нискокалорична диета върху телесното тегло и клиничните параметри. A: телесно тегло преди и след диетичната интервенция при затлъстели хора (н = 8). Кръвни проби бяха събрани след бързо нощуване преди и след диетичната интервенция. Б.: плазмена глюкоза на гладно (н = 8 субекта). ° С: плазмени нива на гладно (н = 7 субекта, стойността на инсулина след диетична интервенция е загубена за един субект поради хемолиза на кръвната проба). д: хемоглобин A1c (HbA1c) (н = 7 субекта). Е.: оценка на хомеостатичен модел на инсулинова резистентност (HOMA-IR), изчислена по формулата (глюкоза mmol/l × инсулин mU/l)/22,5 (н = 7 субекта). F-Аз: триглицериди, холестерол, LDL и HDL плазмени нива (н = 8 субекта). Квадратите и кръговете представляват съответно преди и след диета. Затворените и отворени символи представляват жените (н = 5–6) и мъже (н = 2), съответно. Статистическата значимост беше определена чрез сдвоени т-тестове, когато данните са били нормално разпределени и с Wilcoxon Matched-pair подписан ранг тест, ако не (само триглицериди). P

Експресия на гени в скелетните мускули.

Определен е ефектът от диетичната интервенция върху експресията на ген на скелетни мускули при затлъстели хора. GSEA извлече дванадесет пътища, които бяха засегнати от диетична намеса, включително биосинтез на ненаситени мастни киселини и PI3K-Akt път (Фиг. 2A). Анализът на вулкановия сюжет разкрива, че иРНК на няколко гена се е увеличила след диетична намеса (фиг. 2Б.). Получихме 285 гена (227 намалени и 58 увеличени), показващи повече от 50% промяна в иРНК след диетична намеса. По-специално, иРНК на гени, участващи в транспорта или метаболизма на мастните киселини, включително SLC27A1, MLYCD, и PDK4, беше увеличен, докато SCD1 е намалена (фиг. 2° С). Резултатите от генния масив бяха допълнително валидирани чрез qPCR (Фиг. 2д). Потвърдихме, че иРНК на PDK4 и MLYCD беше увеличен и SCD1 е намален след диетична намеса при затлъстели хора. експресия на иРНК на PGC1α и TFAM е бил непроменен в скелетните мускули след диетична намеса, докато IL6 експресията на иРНК се увеличава умерено.

нискокалорична

Фиг. 2.Анализ на транскриптома на скелетните мускули след диетична намеса при затлъстели хора. A: анализ на обогатяване на генни набори (GSEA), оценяващ данните от микрочиповете на ниво генни набори. Размерът на кръговете показва броя на значително променените гени във всеки път, а цветът показва нивото на значимост. Б.: вулканичен парцел, показващ промени в експресията на гените, корелирани с P стойности (пунктирани линии показват промяна на сгъването> 50% и P

Анализ на липидния профил.

Фиг. 3.Профилът на липидом на скелетните мускули се променя след диетична намеса при затлъстели хора. Липидом на биопсии на скелетни мускули, получени преди и след 3-седмична диетична интервенция, измерена чрез ултрабърза течна хроматография-базирана на липидомичен анализ на масова спектрометрия (н = 8 субекта, сдвоени проби). A: вулканичен парцел, показващ анализирани промени в гънките на липидните видове в корелация с P стойности (пунктирана линия показва P

Съотношение между оценка на хомеостатичния модел на инсулинова резистентност и специфични липидни видове.

Проведохме корелационен анализ между промените в HOMA-IR и значително променените липидни видове в скелетните мускули след диетичната намеса. От 24 липидни вида, променени чрез диетична намеса, промените в 3 липидни вида са положително корелирани с HOMA-IR [PE (36: 1), Фиг. 4A] и с два дълговерижни TG [(54: 0) и (56: 1), фиг. 4, Б. и ° С. Нашите открития предполагат, че 3 от 23-те липидни вида в скелетните мускули, които са били променени чрез диетична интервенция с подобрения в инсулиновата чувствителност на цялото тяло.

Фиг. 4.Асоциация на липидните видове с оценката на хомеостатичния модел на корелация на инсулиновата резистентност (HOMA-IR) между промяна в пъти в HOMA-IR и промяна в фосфатидилетаноламин [PE (36: 1)] (A), триглицерид [TG (54: 0)] (Б.) и TG (56: 1) (° С) с нискокалорична диета в скелетните мускули от затлъстели хора. н = 7 теми, затворените и отворените символи представляват жените (н = 5) и мъже (н = 2), съответно.

Диетичните интервенции са широко използвани стратегии за подобряване на инсулиновата чувствителност и хомеостазата на глюкозата в цялото тяло при възрастни със затлъстяване. Тук предоставяме доказателства, че 3-седмичната нискокалорична диета намалява телесното тегло и подобрява инсулиновата чувствителност, оценена от HOMA-IR при затлъстели хора. Диетичната намеса намалява плазмените нива на TG, холестерола и LDL. След диетична интервенция клиничните подобрения в липидните профили в кръвта и HOMA-IR бяха придружени от промени в профилите на експресия на генни скелетни мускули, с обогатяване на пътя, свързан с метаболизма на мастните киселини. Също така демонстрирахме, че краткосрочната диетична намеса променя липидомичния профил на скелетните мускули, като промените в специфични липидни видове корелират с подобрения в HOMA-IR. Колективно, нашето проучване дава представа за транскриптомното и липидомичното ремоделиране на скелетните мускули и свързаните с това клинични подобрения в инсулиновата чувствителност при затлъстели хора след загуба на тегло.

Краткосрочната интервенция с нискокалорична диета, предписана в това проучване, беше ефективна за намаляване на телесното тегло и подобряване на метаболитните параметри при затлъстели възрастни, което е в съответствие с по-ранни проучвания от нашата група (18) и други (14, 23). Диетичната интервенция е свързана с намалени нива на инсулин и подобрен HOMA-IR, което показва, че чувствителността на инсулина към цялото тяло е повишена. HOMA-IR разчита на стойностите на глюкозата и инсулина на гладно. Докато гладувате, нивото на инсулина регулира производството на чернодробна глюкоза, а нивото на глюкозата на гладно е отражение на този процес. Следователно промените в HOMA-IR отразяват подобрения в инсулиновата чувствителност на черния дроб, а не на скелетните мускули (10). Съобщени са обаче връзки между чувствителността към инсулин на цялото тяло и действието на инсулин на скелетните мускули (33), което предполага, че HOMA-IR също отразява периферната чувствителност към инсулин.

Специфични липидни видове функционират като втори посланици и участват в ремоделирането на метаболизма на скелетните мускули. Липидните междинни продукти като диацилглицерол и керамиди са определени като индуктори на инсулинова резистентност (3, 8). Открихме намаляване на нивото само на един вид керамиди, докато видовете диацилглицерол бяха непроменени. Повишените видове керамиди в скелетните мускули на затлъстели възрастни са свързани с намалено инсулиново медиирано Akt сигнализиране и усвояване на глюкоза (1) Интересното е, че сигналната пътека P13K-Akt също е обогатена в нашия GSEA, което предполага промени в транскрипцията, свързани с подобрена чувствителност към инсулин. Въпреки че не направихме конкретна оценка на инсулиновата сигнализация в скелетните мускули в нашата кохорта, открихме подобрения в HOMA-IR и намаления в нивата на инсулин, което предполага, че инсулиновата чувствителност се е засилила след диетична намеса.

Резистентността към инсулин на скелетните мускули е крайъгълен камък в развитието на диабет тип 2. Въпреки кратката продължителност, диетичната интервенция оказа силно влияние върху инсулиновата чувствителност на цялото тяло и генната експресия и липидомичните профили в скелетните мускули. Разбирането на физиологията на скелетните мускули и молекулярната биология е от съществено значение за напредъка на новите подходи за противодействие на ранното развитие на инсулиновата резистентност. Бъдещи проучвания, за да се определи дали профилът на серумния липиден метаболит отразява липидомния профил на скелетните мускули след диетична намеса, могат да идентифицират лесно достъпни биомаркери за проследяване на подобрения в инсулиновата чувствителност и метаболитната хомеостаза. Нашето проучване, което интегрира клинични данни с обективни генни масиви и липидомичен анализ, идентифицира специфични метаболитни гени и липидни видове в скелетните мускули, които проследяват с подобрения в инсулиновата чувствителност след диетична намеса. Той също така помага за молекулярното разбиране на хомеостазата на глюкозата в цялото тяло и метаболитните подобрения, постигнати във връзка със загуба на тегло.

Тази работа беше финансирана от Фондация Novo Nordisk, Програма за стратегически изследвания в областта на диабета в Karolinska Institutet, Програма за идеи на Европейския съвет за научни изследвания (ICEBERG, ERC-2008-AdG23285), Шведски изследователски съвет (2011-3550), Шведска фондация за диабет (DIA2015-052 ) и Шведска фондация за стратегически изследвания (SRL10-0027). C. Nylén беше подкрепен от окръжен съвет на Стокхолм (SLL) чрез дарение „Forskar-ST“.

Не се декларират конфликти на интереси, финансови или други, от авторите.