Резюме

Кетогенната диета (KD) е ефикасна терапия за медицинска рефрактерна детска епилепсия, която също забавя наддаването на тегло. Тествахме хипотезата, че KD забавя наддаването на тегло чрез неврохормони, участващи в енергийната хомеостаза. Установихме, че младите гризачи, хранени с KD, имат по-бавно наддаване на тегло от тези, хранени със стандартна диета (SD). Плъховете, хранени с KD, са имали по-високи нива на серумен лептин и по-ниски нива на инсулин в сравнение с тези, хранени със SD. Допълнително изследвахме повишаването на лептина, тъй като тази промяна беше единствената в съответствие с по-бавното наддаване на тегло. Въпреки че плъховете, хранени със SD, са имали по-бавно наддаване на тегло, когато калориите са ограничени, те са имали серумни нива на лептин, подобни на тези, хранени със SD ad libitum. Освен това, липса на лептин (ob/ob) и липса на лептинов рецептор (db/db) мишките не показват по-бавно наддаване на тегло на KD. Всички животни на KD имат повишени серумни нива на β-хидроксибутират (βHB). По този начин кетозата е недостатъчна и функционираща система за сигнализиране за лептин изглежда необходима за KD да забави наддаването на тегло. Увеличаването на лептина може да допринесе за антиконвулсантните ефекти на KD.

Съществуват малко възможности за лечение на 20–30% от децата с епилепсия, чиито гърчове не са устойчиви на лекарства. Единият вариант е KD, богата на мазнини, нисковъглехидратна и адекватна протеинова диета. KD е забележително ефективен при деца с медицинска рефрактерна епилепсия, тъй като 5-10% стават без припадъци, а 30% имат> 90% намаляване на честотата на пристъпите (1). И все пак неблагоприятните му ефекти и родителските усилия, свързани с прилагането и поддържането на диетата, ограничават употребата му. По този начин всички деца с епилепсия биха се възползвали от по-прост метод за постигане на антиконвулсивните ефекти на диетата, който изисква изясняване на механизма на нейното действие.

Тук се фокусираме върху това, което нарушеното наддаване на тегло, свързано с KD, може да разкрие за антиконвулсивния механизъм на диетата. Няколко проучвания съобщават, че децата с KD падат с около 10 процентила тегло, въпреки че целта е подходящо наддаване на тегло (2,3). Признаването, че диетите с ниско съдържание на въглехидрати, като диетата на Аткинс, са кетогенни, прави това нарушено наддаване на тегло по-малко изненадващо. Всъщност диетата на Аткинс и други KD с ниско съдържание на въглехидрати водят до загуба на тегло от 5% до 10% за 6 месеца (4,5). Освен това гризачите, поставени на KD, показват по-бавно наддаване на тегло (6,7).

Ние предположихме, че антиконвулсантните и тегловните ефекти на KD споделят общ механизъм, включващ промяна в серумните нива на лептин, инсулин, грелин или кортизол. Тези периферно освободени хормони помагат да се определи телесното тегло, защото те регулират енергийната хомеостаза (8). Важното е, че лептинът и инсулинът също модулират невронната възбудимост (9,10).

МЕТОДИ

Диетични протоколи.

Експерименталните протоколи бяха одобрени от Комитета за изследвания на животните във Вашингтонския университет. Плъхове Sprague-Dawley (Charles River Laboratories, Wilmington, MA), мъжки ob/ob мишки (запас 000632, лабораторията Джаксън, Бар Харбър, МЕ), мъжки мишки C57BL/6J (запас 000664, лабораторията Джаксън), мъже db/db мишки (запас 000642, лабораторията на Джаксън) и мъжки мишки C57BLKS/J (запас 000662, лабораторията на Джаксън) бяха настанени при 12-часов цикъл светлина/тъмнина. Експериментите с плъхове започнаха на постнаталния ден (PD) 21, деня на отбиването, и тези с мишки започнаха, когато ob/ob и db/db мишките са фенотипно идентифицируеми. Клетките държат четири до шест плъха или две до три мишки. Всички животни са имали ad libitum достъп до вода. Те бяха хранени със SD (диета за гризачи 20, PicoLab, Ричмънд, Индиана), KD (F3666; Bio-Serv, Frenchtown, NJ) или диета с ограничено съдържание на калории (CD). Животните на SD получават 12% от калориите си от мазнини, 65% от въглехидрати и 24% от протеини. По тегло SD съдържа 20% протеин, 5% мазнини, 5% фибри, 55% въглехидрати и 6% пепел. Животните в KD получават 92% от калориите си от мазнини, 3% от въглехидрати и 5% от протеини. По тегло KD е 8% до 9% протеин, 75% мазнини (45% свинска мас, 19% масло и 10% царевично масло), 4% фибри, 3% пепел, 4% до 6% въглехидрати, Фигура 3

допринася

Анализ на данни.

Парцели с телесно тегло или нормализиран калориен прием срещу PD бяха сравнени, използвайки дисперсионен анализ на многократни мерки (ANOVA) (SPSS, Чикаго, IL). Средствата са сравнени от a т тест или ANOVA с Tukey's post hoc сравнение на средствата (OriginLab, Northampton, MA). Линейните напасвания бяха получени чрез линейна регресия. Данните са представени като средна стойност ± стандартна грешка на средната стойност (SEM). Статистическата значимост беше определена на стр

РЕЗУЛТАТИ

Ювенилните плъхове на Sprague-Dawley натрупват тегло по-бавно при KD.

Хранехме млади младежи от плъхове Sprague-Dawley с KD или SD за 2 седмици. Избрахме млади плъхове, тъй като по-младите животни са по-добре приспособени за кетоза (14). KD чау е същият чау, използван в няколко други проучвания на гризачи (6,7,15). Плъховете понасяха KD без затруднения. Те изглеждаха толкова здрави и активни, колкото техните съседни деца, хранещи SD.

Котилите на KD наддават тегло значително по-бавно, отколкото техните братя и сестри, хранени с SD, както беше отбелязано по-рано (6,7) (Фиг. 1A). Мокри тегла на сърцето, черния дроб и бъбреците са с 33% до 48% по-ниски, докато мозъчната маса се запазва след 2 седмици на KD (Фиг. 1,Б.-Е.). Освен разликите в масата, органите от плъхове, хранени с KD, не се различават грубо от тези, хранени с SD, с изключение на черния дроб, който е мастен. За да определим дали ефектът на KD върху телесното тегло е обратим, поставихме плъхове върху SD от PD 21 до PD 25, диетата KD от PD 26 до PD 30 и SD от PD 31 до PD 35. Тези животни имаха по-бавен темп на растеж по време на KD, който се обърна при връщане към SD (Фиг. 1A). Интересното е, че плъховете на KD имат по-висок нормализиран прием на калории от тези на SD (Фиг. 1F). По този начин KD обратимо забавя наддаването на тегло, включително това на чиста телесна маса при млади плъхове, като същевременно поддържа мозъчния растеж.

Повишен серумен лептин при млади плъхове Sprague-Dawley, хранени с KD.

Един механизъм, чрез който KD може да забави наддаването на тегло, е чрез промяна на нивата на серумния лептин, инсулин, грелин и кортизол, които са хормони, участващи в регулирането на енергийната хомеостаза (8). Ние предположихме, че KD забавя увеличаването на теглото чрез увеличаване на лептина, увеличаване на инсулина, намаляване на грелина или намаляване на нивата на кортизол.

Плъховете на KD за 2 седмици са имали 10 пъти по-високи обедни серумни нива на βHB и 30% по-ниски нива на глюкоза от плъховете на SD (Фиг. 2A и Б.). Повишените нива на βHB показват, че KD произвежда кетоза. Очакваше се по-ниска глюкоза, тъй като диетите с ниско съдържание на въглехидрати могат да понижат кръвната захар при хората (5,16). Плъховете на KD също са имали 140% по-високи нива на лептин, 72% по-ниски нива на инсулин и леко повишени нива на кортизол, но сходни нива на грелин в обед в сравнение с плъхове на SD (Фиг. 2° С-F). Пет дни на KD произвеждат по-малки увеличения на серумния βHB и лептин от 2 седмици на KD, като промените са значителни и се обръщат при връщане в SD (Фиг. 2A и F). Въпреки че диетите с ниско съдържание на протеини също забавят наддаването на тегло, намаляват нивата на инсулин и могат да повишат нивата на лептин (17,18), те повишават нивата на грелин (19), което предполага, че нашите резултати не произтичат само от ниско съдържание на протеини в KD . От наблюдаваните хормонални промени само увеличаването на лептина може да забави наддаването на тегло.

Изследвахме как серумните βHB и лептинът варират в зависимост от теглото поради известната връзка между тези параметри. Затлъстелите хора, хранени с нисковъглехидратна диета, изпитват по-голяма загуба на тегло с по-високи нива на βHB (4). Както за SD, така и за KD, плъховете с най-високи нива на βHB в деня на жертвата тежат най-малко (фиг. 2G). При гризачите серумните нива на лептин корелират с индекса на телесна маса (20). Въпреки че нивата на тегло и лептин не корелират при плъхове на SD, плъховете с по-високи нива на лептин на KD тежат повече (Фиг. 2З.). Както за SD, така и за KD, нито инсулинът, нито съотношението лептин: инсулин корелират с теглото.

Серумният лептин не се увеличава при младите плъхове Sprague-Dawley, хранени с CD.

В друг експеримент сравнихме кривите на нарастване на теглото и серумните нива на лептин при плъхове, хранени с KD, CD или SD. Хранихме непълнолетни плъхове с KD, CD или SD за 2 седмици. Плъховете на KD и CD натрупват тегло по-бавно, отколкото техните братя и сестри, хранени с SD (Фиг. 3A). Мастната маса на плъховете на KD като процент от общата маса е два до три пъти по-голяма от тази на плъховете на SD или CD (фиг. 3Б.). Плъховете на KD са имали шест пъти по-висок βHB от плъховете, хранени или със SD или CD (Фиг. 3° С). По отношение на SD промените, индуцирани от KD и CD в нивата на лептин, корелират с промените в мастната маса (Фиг. 3д). Плъховете на компактдиска имаха достъп до чау непосредствено преди жертвоприношение, както и плъховете на SD и KD. За плъховете на CD достъпът до чау непосредствено преди жертвата трябва да доведе до максимални нива на лептин (11) и може да намали нивата на βHB. Тези резултати показват, че повишаването на серумния βHB и лептин, индуцирано от KD, не е резултат от по-бавен растеж.

Ювенилните ob/ob и db/db мишки не наддават по-бавно на тегло при KD.

Фоновият щам на ob/ob и db/db мишки не повлияват ефектите на KD. C57BL/6J (фонов щам за ob/ob мишки) и C57BLKS/J (фонов щам за db/db мишки) мишки, хранени с KD, напълняват по-бавно от тези, хранени със SD (Фиг. 4A и 5A). KD намалява нормализирания прием на калории при C57BLKS/J, но не и при мишките C57BL/6J (Фиг. 4Б. и 5Б.). KD повишава обедните серумни βHB нива при мишки C57BL/6J с 10 пъти и при мишки C57BLKS/J с шест пъти (Фиг. 4° С и 5° С). KD повишава серумните нива на лептин с поне 130% при мишки C57BL/6J и C57BLKS/J (Фиг. 4д и 5д).

ДИСКУСИЯ

Възпроизведохме KD, индуцирано по-бавно наддаване на тегло при деца с епилепсия при няколко щама млади плъхове и мишки. Животните на KD са имали по-високи нива на серумен лептин, по-ниски нива на инсулин, леко повишени нива на кортизол и подобни нива на грелин в сравнение с животните, хранени със SD. Само промяната в лептина е в съответствие с по-бавното наддаване на тегло. Неуспехът на KD да забави наддаването на тегло в ob/ob и db/db мишки поддържа ролята на лептина в този процес.

Нашите резултати се различават от резултатите от скорошно проучване, което установи повишени нива на грелин при плъхове, хранени с KD (22). Можем да прогнозираме такова увеличение, тъй като нивата на грелин се повишават във връзка с по-бавното наддаване на тегло, наблюдавано при плъхове при диети с ограничено протеиново съдържание (19). Въпреки че ниското съдържание на протеин в KD, което използвахме, може да е допринесло за нашите констатации (7), липсата на промяна в грелина и три други наблюдения показват, че това не е единственият замесен фактор. Първо, KD поддържа нормално наддаване на тегло през ob/ob и db/db мишки. Второ, плъховете, хранени с KD, показват относително добре запазена чиста маса, изразена като процент от телесната маса. Трето, пиковите нива на лептин на CD не надвишават най-ниските нива на лептин на SD, въпреки по-бавното наддаване на тегло на CD.

В крайна сметка KD трябва да увеличи енергийните разходи над енергийния прием, за да забави наддаването на тегло. KD имаше променливи ефекти върху нормализирания прием на калории въпреки постоянното забавяне на наддаването на тегло. Намалява калорийния прием при C57BLKS/J, db/db, и ob/ob мишки, не са имали ефект върху приема на калории при мишки C57BL/J6 и повишен прием на калории при плъхове Sprague-Dawley. Въпреки че мазната консистенция на KD чау затруднява измерванията на калориен прием, като цяло нашите открития показват, че KD може да намали приема на храна и да увеличи енергийните разходи, които са известни ефекти на лептина (8).

Нашите резултати подкрепят хипотезата, че KD упражнява своите антиконвулсантни ефекти чрез активиране на различни калиеви канали чрез метаболитните промени, които предизвиква (27). Спекулираме, че индуцираното от KD повишаване на серумния лептин увеличава нивата на мозъчен лептин, тъй като мозъчните нива са пропорционални на серумните нива (28). Очакваме дифузно увеличение на мозъчните нива, тъй като транспортиращите лептин съществуват в целия мозък (28), а лептинът се увеличава в целия мозък, когато се прилага екзогенно (29). Лептинът може да действа като антиконвулсант в целия мозък, тъй като рецепторите за лептин съществуват в целия мозък (28) и активират калциево активирани калиеви канали (9). Намаляването на инсулина обаче може да противодейства на някои от ефектите от повишаването на лептина, тъй като инсулинът активира същия канал (10). В обобщение, предполагаме, че KD произвежда нетен антиконвулсант отчасти, защото увеличеният мозъчен лептин активира калиевите канали. Този механизъм може да е уникален сред антиепилептичните лекарства, които не повишават лептина независимо от наддаването на тегло (30–32). Нашите резултати не изключват лептиновата модулация на невроналната или глиалната енергийна хомеостаза или други механизми, включващи сложните метаболитни и клетъчни ефекти на KD, от принос за неговите антиконвулсантни свойства (27).

Въпреки фокуса ни върху лептина, други неврохормони могат да допринесат за антиконвулсантните и тегловни ефекти на KD. Например повишените нива на кортизол, които открихме при плъхове на KD, отразяват увеличението, наблюдавано при деца на KD и могат да допринесат за антиконвулсивния ефект на диетата (33). Други са разгледали възможността промените в експресията на невропептид Y и галанин да допринесат за ефектите на KD, но диетата не променя нивата на техните иРНК в мозъка (34). Вместо да изключим принос на други неврохормони, нашите резултати показват, че изучаването на KD-индуцирани промени в неврохормоните, участващи в енергийната хомеостаза, може да помогне за изясняване на механизмите, лежащи в основата на антиконвулсантните и тегловни ефекти на KD.