Резюме

α-липоевата киселина функционира като кофактор в мултиензимни комплекси, включително пируват дехидрогеназа, α-кетогутарат дехидрогеназа и разклонена верига α-кетокиселина дехидрогеназа (11). α-липоевата киселина и нейната редуцирана форма, дихидролипоат, са мощни антиоксиданти. Те са амфифилни и широко разпространени както в клетъчната мембрана, така и в цитозола и лесно преминават кръвно-мозъчната бариера. Те хелатират преходните метали и могат да се регенерират от няколко ензима, включително липоамид редуктаза, глутатион редуктаза и тиоредоксин редуктаза. Освен това, а-липоевата киселина/дихидролипоат рециклира други антиоксиданти, като глутатион, витамин С, витамин Е и коензим Q10 (12). α-липоевата киселина се използва в Германия за пациенти с диабетна невропатия от> 30 години и неотдавнашен мета-анализ показа, че лечението с 600 mg α-липоева киселина на ден в продължение на 3 седмици е безопасно и намалява невропатичния дефицит от клинично значимо степен при пациенти с диабет със симптоматична полиневропатия (13,14). Въпреки това, ефектите от лечението с α-липоева киселина при дози, които предизвикват значително намаляване на оксидативния стрес, не са ясно демонстрирани при сърдечно-съдови заболявания при диабет.

предотвратява

Настоящото проучване изследва ефекта на хранителната добавка на а-липоева киселина върху атеросклерозата, за която е известно, че се засилва от индуцирания от стрептозотоцин (STZ) диабет при аполипопротеинови (апо) Е-дефицитни мишки (15). Тук показваме, че диетичната α-липоева киселина, стартирана след индуцирането на диабет от STZ приложение, води до значителни промени в биомаркерите на оксидативен стрес и напълно предотвратява ускорената атеросклероза, наблюдавана при диабетни апоЕ -/- мишки, които не са получили добавката.

ПРОЕКТИРАНЕ И МЕТОДИ НА ИЗСЛЕДВАНИЯТА

Експерименти с мишки бяха проведени по протоколи, одобрени от институционалната комисия за грижи и употреба на животните. Мъжки 12-седмични апоЕ -/- мишки на генетичен фон C57BL/6J са направени диабетици с интраперитонеални инжекции на STZ (Sigma, Сейнт Луис, МО) при 40 mg/kg телесно тегло в 0,1 mol/l цитратен буфер ( рН 4,5) в продължение на 5 последователни дни. Контролна група получи само буфер. Мишки с нива на глюкоза в кръвта> 300 mg/dl на 4 седмици след първоначалното приложение на STZ се считат за диабет и са използвани в това проучване. Както STZ-администрираните, така и контролните апоЕ -/- мишки се поддържат в редовен режим на чау до 4 седмици след започване на приложението на STZ, когато преминават към полусинтетична диета с високо съдържание на мазнини (23% тегл./Тегл.), Но с ниско съдържание на холестерол (0,05% wt/wt), със или без 1,65 g/kg α-липоева киселина (D03120501, D03120502; Research Diets, New Brunswick, NJ). Източникът на калории в диетата с високо съдържание на мазнини (45% мазнини, 35% въглехидрати и 20% захароза) е подобен на диетите, консумирани от хората в западните общества. Мишките имаха свободен достъп до диета и вода и бяха наблюдавани внимателно за тяхното здраве. Животните бяха убити за анализи на 20 седмици след започване на администрацията на STZ.

Биохимичен анализ.

Мишките бяха на гладно в продължение на 4 часа и кръвните проби бяха събрани от ретро-орбиталния синус преди STZ инжекции и на всеки 4 седмици след това. Плазмените нива на глюкоза, общ холестерол и триглицериди се измерват с налични в търговската мрежа комплекти (Wako, Richmond, VA). Профилите на плазмените липопротеини се определят, като се използва течна хроматография с бърз протеин (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ). Липопротеините са изолирани от обединената плазма чрез ултрацентрифугиране (16).

Съдържанието на плазмен липиден пероксид се определя, като се използва анализ на реактивно вещество с тиобарбитурова киселина (TBARS) (17). Еритроцитният глутатион се измерва с пробен комплект (Calbiochem, San Diego, CA). Активността на серумна параоксоназа се определя спектрофотометрично при 270 nm с фенилацетат като субстрат (18).

Мишките бяха поставяни индивидуално в метаболитни клетки ежемесечно в продължение на 3 последователни дни след започване на приложението на STZ. Консумацията на вода и храна, обемът на урината и телесното тегло се наблюдават за период от 24 часа. Нивата на 8-изопростан в урината бяха определени с помощта на набор за анализ на ензимен имуносорбент (Cayman, Ann Arbor, MI).

Анализ на атеросклеротична лезия.

Анализите на атеросклеротични лезии следват стандартния протокол в нашата лаборатория (16). Замразените участъци на проксималната аорта бяха оцветени със Судан IV и оцветени с хематоксилин. Площите на атеросклеротичните лезии бяха измерени с помощта на Националния здравен институт 1.59 Imaging Software (19). Като размер на лезията на всяко животно се приема средната стойност на зоните на лезии в участъци от четири анатомично дефинирани позиции.

Имунохистохимия.

Имунооцветяването се извършва върху панкреаса, като се използва стандартен метод на комплекс авидин/биотин с поликлонален морски свинче анти-инсулин (разреждане 1: 1000; Dako, Carpinteria, CA) и биотинилиран имуноглобулин против морско свинче (1: 400 разреждане; Vector Laboratories, Burlingame, Калифорния) (20). За отрицателната контрола неимунният серум е заместен с първично антитяло. Бяха анализирани най-малко 10 островчета на мишка от пет мишки от всяка експериментална група, използвайки софтуера на National Institutes of Health ImageJ 1.34 (достъпен онлайн от http://rsb.info.nih.gov/ij).

Статистика.

Всички стойности са средните стойности ± SE. Статистическият анализ беше извършен с помощта на JMP софтуер (SAS, Cary, NC). Ефектите на диабета и α-липоевата киселина и техните взаимодействия бяха анализирани с помощта на двупосочна ANOVA и честно значимата разлика на Tukey-Kramer беше използвана за множество сравнения. Ефектите от продължителността на диабета се оценяват чрез множество ANOVA от повтарящи се мерки на всяка мишка.

РЕЗУЛТАТИ

Индуциран от STZ диабет при апоЕ -/- мишки.

3 месеца след започване на приложението на STZ, много от диабетните мишки, които не получават а-липоева киселина, започват да показват признаци на заболяване, включително летаргия. От 29 мишки от тази група, 3 са били убити преждевременно преди края на проучването, когато са започнали да показват признаци на тежка дехидратация и изразена загуба на телесно тегло. Грубите и хистологични изследвания на тези мишки не показват възпаление или некроза в чернодробната и бъбречната тъкан или някакви съдови аномалии като тромбични образувания. За разлика от това, всички 16 хранени с α-липоева киселина диабетни животни изглеждаха здрави през целия период на изследване и достигнаха до прекратяване на експеримента, 20 седмици след приложението на STZ.

Промените в телесното тегло през експерименталния период на диабетни и недиабетни мишки са илюстрирани на фиг. 1А. Въпреки че диетата с високо съдържание на мазнини причинява значително увеличаване на теглото при недиабетните мишки, диетичната α-липоева киселина значително забавя това увеличение, въпреки че групата консумира подобно количество диета дневно (4,8 ± 0,3 g с α-липоева киселина срещу 4,9 ± 0,4 без α-липоева киселина). В края на експериментите контролните животни без а-липоева киселина тежат 42,7 ± 1,0 g в сравнение с 40 ± 0,5 g за тези, които получават а-липоева киселина (P -/- мишки.

Плазмени липиди.

Мишките, хранени с високомаслена диета с нисък холестерол, са имали по-високо ниво на холестерол в плазмата (343 ± 9 mg/dl, n = 10) от мишките, хранени с нормална храна (317 ± 9, n = 10), но разликата не достига значимост (Р = 0,07). Нито приложението на STZ, нито хипергликемията променят значително плазмените нива на холестерол и триглицериди на мишките със или без α-липоева киселина през първите 4 месеца след приложението на STZ (Фиг. 2А и В). Въпреки това, на 5 месеца след STZ приложение, плазмените нива на холестерол (685 ± 57 mg/dl) при диабетни мишки без а-липоева киселина са значително по-високи (P 1000 mg/dl холестерол, придружен от повишени триглицериди. Плазмените нива на холестерол на мишките получаващи диетична α-липоева киселина (474 ​​± ​​10 mg/dl) остава същата като при недиабетни мишки.Диабетът причинява малко, но значително увеличение на плазмените триглицериди (P -/- мишки с α-липоева киселина не се различава от тази при недиабетна апоЕ -/- мишки. За разлика от тях, диабетичните мишки без α-липоева киселина имат ∼60% повече холестерол във VLDL, липопротеин със средна плътност и LDL в сравнение с диабетните мишки apoE -/- с α-липоева киселина (Фиг. Α-Липоевата киселина не е оказала ефект върху нивата на HDL холестерол.

Тези данни показват, че продължителният нелекуван диабет увеличава плазмените холестерол и остатъци от липопротеинови частици при апоЕ -/- мишки и че добавянето на α-липоева киселина предотвратява тези промени.

Биомаркери за оксидативен стрес.

Нивата на еритроцитен глутатион и плазмени TBARS при 2-месечни мишки ApoE -/- при редовна чау са съответно 28,3 ± 1,5 и 12,3 ± 0,6 mg/ml. Храненето на диета с високо съдържание на мазнини на тези мишки за ≥4 седмици не променя значително нивата (съответно 28,3 ± 1,1 и 13,3 ± 0,6 mg/ml; n = 26). Както се очаква, обаче, диабетът повишава оксидативния стрес, както се доказва от по-ниския еритроцитен глутатион при диабетни мишки, отколкото при недиабетни контроли на 5-месечно приложение след STZ. Диетичната α-липоева киселина значително увеличава еритроцитния глутатион както при недиабетните, така и при диабетните животни с 33% (P -/- мишки с ∼40% в сравнение с недиабетичните мишки (P -/- мишки и че хранителната добавка с α-липоева киселина ограничава това нараства.

Развитие на атеросклеротична лезия.

След това оценихме как хранителните добавки с α-липоева киселина влияят върху развитието на атеросклеротични лезии при апоЕ -/- мишки (Фиг. 4). При недиабетните мишки диетичната α-липоева киселина причинява малко незначително намаляване на размера на плаката (P = 0,22) (фиг. 4). При мишки без α-липоева киселина, диабетът причинява значително увеличение (P -/- мишки. Ефектът от диабета и диетата са съществени (P -/- мишки от диабет.

Имунохистохимия на β-клетките на панкреаса.

Доказателствата за свързване на антиоксидантните витамини със сърдечно-съдови заболявания при хората все още са до голяма степен противоречиви (22). Изследването на ролята на различните антиоксиданти върху атеросклеротичните мишки също дава противоречиви резултати. Някои проучвания показват инхибиращи ефекти на антиоксидантите като витамин Е (22,23) или комбинация от витамини С и Е и β-каротин (24). За разлика от това, други не са показали ефект само на витамин Е (25) или в комбинация с β-каротин (26). В някои случаи антиоксидантите като пробукол имат вредно въздействие и увеличават размера на плаката (27). Нашите текущи данни показват, че хранителните добавки с а-липоева киселина значително намаляват оксидативния стрес, както е показано от плазмени TBARS, еритроцитен глутатион и 8-изопростан в урината, и изглежда, че има малък защитен ефект върху атерогенезата при недиабетните апоЕ -/- мишки . Тези наблюдения съвпадат с по-ранните доклади, че диетичната α-липоева киселина намалява съдържанието на холестерол в аортните тъкани на заети, хранени с холестерол (28) и че α-липоевата киселина има превантивен ефект върху атеросклерозата, индуцирана от холестерола при японските пъдпъдъци (29). Тези резултати от експерименти с животни предполагат, че по-нататъшното изследване на ефектите на а-липоевата киселина върху атеросклерозата при хора би било оправдано.

На 5 месеца след приложението на STZ, някои мишки развиват тежка хиперлипидемия. Въпреки това, атеросклерозата при тези мишки не е по-лоша от тази при други и елиминирането на тези животни от анализи не променя значението на нито един от изследваните от нас параметри, включително атеросклероза и биомаркери на оксидативен стрес. Renard и сътр. (20) наскоро генерира нов трансгенен миши модел на диабет тип 1, който може да бъде индуциран от инфекция с лимфоцитен хориоменингит вирус. Те съобщават, че диабетът причинява ускорено започване на лезия при липса на липидни аномалии при мишки с дефицит на LDL рецептор на диета без холестерол, докато при мишки с диабет, хранени с богата на холестерол диета, прогресията към напреднали лезии до голяма степен зависи от индуцирания от диабет дислипидемия (20). Въпреки че нашите експерименти се различават от техните не само в модели, но и в диети, горните наблюдения предполагат, че защитата от индуцирана от диабет хиперлипидемия е малко вероятно да бъде единствената причина за атеропротекция от α-липоева киселина при апоЕ -/- мишки.

В допълнение към предотвратяването на тежка загуба на телесно тегло при мишки с диабет, нашите експерименти разкриват, че α-липоевата киселина също предотвратява наддаването на тегло, което се е случило при недиабетни мишки ApoE -/-, хранени с високо съдържание на мазнини. По този начин недиабетичните мишки, на които се дава диета с а-липоева киселина, са значително по-малко затлъстели, отколкото техните съношници, хранени с диета без а-липоева киселина, въпреки че консумират подобни количества диета ежедневно. Преди това Kim et al. (47) демонстрира, че α-липоевата киселина значително намалява приема на храна и телесното тегло на плъховете Sprague-Dawley в зависимост от дозата и че централната нервна система е основното място на анорексичния ефект на α-липоевата киселина. За разлика от това, недиабетните мишки в нашите експерименти не показват загуба на апетит. Тази разлика може да се дължи на това, че използвахме по-ниска доза α-липоева киселина, отколкото в експериментите на Kim et al. и/или поради различни видове. Тъй като затлъстяването е важен рисков фактор за развитието на диабет тип 2 и атеросклероза, функцията за затлъстяване на α-липоевата киселина може да бъде допълнителна полза.

В обобщение, нашето проучване показва, че хранителните добавки на α-липоева киселина в продължение на 20 седмици напълно предпазват апоЕ -/- мишките от засилване на аортната атеросклероза, причинена от индуциран от STZ диабет. Основните механизми, чрез които а-липоевата киселина упражнява своите атеропротективни ефекти, включват значително намаляване на оксидативния стрес, водещо до намалено окисление на LDL, защита от индуцирано от диабет повишаване на плазмения холестерол и малко намаляване на нивата на глюкоза в плазмата, придружено от повишена защита/възстановяване на β -клетки от повреда. Въпреки че настоящото проучване не може напълно да различи относителния принос на тези фактори, заедно с установената клинична ефикасност на α-липоевата киселина върху диабетната невропатия, нашите резултати показват, че α-липоевата киселина има обещание като защитен агент срещу сърдечно-съдовите усложнения на диабета.