Beiyun Wang

1 Катедра по геронтология, Шанхайска шеста болница за хора, свързана с Шанхайския университет Jiaotong, 600 Yishan Road, Шанхай 200233, Китай

макрофагичната

Юан Джун

1 Катедра по геронтология, Шанхайска шеста болница за хора, свързана с Шанхайския университет Jiaotong, 600 Yishan Road, Шанхай 200233, Китай

Донг Хуанг

2 Катедра по кардиология, Шанхайската шеста болница за хора, свързана с Шанхайския университет Jiaotong, 600 Yishan Road, Шанхай 200233, Китай

Jingbo Li

2 Катедра по кардиология, Шанхайска шеста болница, свързана с Шанхайския университет Jiaotong, 600 Yishan Road, Шанхай 200233, Китай

Резюме

Въведение

Основните патологични събития при атеросклерозата са индуцираното от хронично възпаление отлагане на липиди и фиброзни елементи в артериалната стена на големи и средни артерии. Атеросклерозата е основната причина за сърдечни заболявания и инсулт, което води до много смъртни случаи при възрастни хора. Атеросклерозата е резултат от неадаптивна възпалителна реакция, която се инициира от интрамуралното задържане на богати на холестерол, съдържащи аполипопротеин В липопротеини в чувствителни области на артериалната васкулатура [1,2]. Аполипопротеин Е (ApoE) е добре известен силен супресор на атеросклерозата, при който той не само регулира транспорта на липопротеини и контролира клетъчната липидна регулация, но и инхибира появата на възпаление [3,4]. В съответствие с тези понятия мишките с дефицит на ApoE (ApoE -/-) показват засилено хронично възпаление в отговор на хиперхолестеролемия и засилен остър имунен отговор за бактериален липополизахарид (LPS) [3-9]. Диетата с високо съдържание на мазнини (HFD) предизвиква развитие на атеросклероза при ApoE -/- мишки за 12 седмици, което е използвано като модел за експериментална атеросклероза [10-12].

Автофагията е катаболен път, който разгражда и рециклира клетъчните отделения за оцеляване на клетките при различни стресове, докато нейният отказ често води до клетъчна смърт [13]. Свързаният с микротубули протеин 1А/1В-лека верига 3 (LC3) е разтворим клетъчен протеин. По време на автофагия автофагозомите поглъщат цитоплазмени компоненти, което води до конюгиране на цитозолна форма на LC3 (LC3-I) с фосфатидилетаноламин, за да образува конюгат LC3-фосфатидилетаноламин (LC3-II). По този начин съотношението на LC3-II към LC3-I представлява автофагичната активност [13-15]. Аутофагия-асоцииран протеин 6 (Atg6 или Beclin-1), ATG7 и p62 са няколко ключови автофаги-асоциирани протеини, които силно индуцират автофагия по независим или координиран начин [16].

Липопротеините, които са изолирани в артериалната стена, са податливи на различни модификации, които правят тези частици провъзпалителни и които индуцират активирането на горните ендотелни клетки. Последващият имунен отговор се медиира от набирането на клетки, получени от моноцити, в суб-ендотелното пространство, където те се диференцират в макрофаги, които поглъщат депозираните липопротеини и след това се трансформират в натоварени с холестерол клетки от пяна. Клетките с пяна, обикновено класифицирани като вид макрофаги, продължават да съществуват в плаки, което насърчава прогресирането на заболяването. Следователно макрофагите играят ключова роля в развитието на атеросклероза [17-20].

Въпреки това липсва проучване на молекулярните механизми, лежащи в основата на контрола на автофагията на макрофагите в развитието на атеросклероза.

МикроРНК (miRNAs) са малки некодиращи РНК, които регулират транслацията на протеини чрез сдвояването на основата с 3’-нетранслирания регион (3’-UTR) на целевите иРНК [21-27]. MiRNAs играят съществена роля в регулирането на атеросклерозата [5,28,29]. Сред всички miRNAs, miR-384-5p едва наскоро бе показано, че играе роля във функцията на нервната система [30,31]. Въпреки това, роля на miR-384-5p в атеросклерозата не е докладвана.

В настоящото проучване установихме, че мишките ApoE (-/-), третирани с високо съдържание на мазнини и диета (HFD), развиват атеросклероза за 12 седмици, докато контролните мишки ApoE (-/-), които са получавали нормална диета (опростена като NOR мишки) не. В сравнение с NOR мишки, HFD мишките са имали значително повече смърт на макрофаги и значително по-ниска автофагия на макрофагите, в резултат на намаления в Beclin-1. Нещо повече, намаленията на Beclin-1 в макрофагите се дължат на HFD-индуцирано увеличение на miR-384-5p, което потиска транслацията на Beclin-1 mRNA чрез 3’-UTR свързване.

Материали и методи

Декларация за етика

Проучването е одобрено от Комитета за грижи и употреба на животните на Шанхайската болница за шести хора, свързана с Шанхайския университет Jiaotong. Всички експериментални процедури са извършени в съответствие с Ръководството за грижа и използване на лабораторни животни, публикувано от Националния здравен институт на САЩ. Всички експерименти са проведени под наблюдението на институционалния комитет по грижа и употреба на животните в съоръжението съгласно одобрения от институционалния комитет по грижа и употреба на животните протокол.

Модел на атеросклероза на мишки

Осемседмични мъжки мишки ApoE (-/-) са закупени от лабораторията Jackson (Bar Harbor, ME, САЩ) или отглеждани в къщи и отглеждани в стерилни условия и стандартни условия за животните (температура, 21 ± 1 ° C; влажност, 55-60%). Животните бяха разделени на случаен принцип в две групи: група с нормална диета (NOR) и група с високо съдържание на мазнини (HFD). Животните от HFD групата се поддържат в продължение на 12 седмици, за да предизвикат атеросклероза, след което аортите се изрязват от мишките. Корените на аортата, заедно с основната част на сърцето, бяха фиксирани с 4% параформалдехид в продължение на 4 часа, криозащитени в 30% захароза за 12 часа и след това вградени в OCT съединение. Тъканта беше напречно сечена на участъци с дебелина 6 μm. Атеросклеротичните лезии на аортния корен бяха изследвани чрез H&E оцветяване. Маслено червено O оцветяване се извършва съгласно инструкциите на производителя, за да се покаже отлагането на липиди с комплект за оцветяване с Oil red O (Abcam, Cambridge, MA, USA). Количественото определяне на изображенията беше измерено с помощта на софтуера NIH ImageJ (Bethesda, MD, САЩ). Данните са изчислени от 10 мишки за всяка група. За всяка мишка за количествено определяне бяха използвани 3 диапозитива, които бяха на разстояние 50 µm един от друг.

Трансфекция на макрофаги

Културни среди за първични миши макрофаги са DMEM среди (Invitrogen, СА, Карлсбад, САЩ), допълнени с ендотелни клетъчни растежни фактори, 5% фетален говежди серум (FBS, Invitrogen) и 1% пеницилин/стрептомицин (Invitrogen). Клетките се държат при 37 ° С с 5% СО2. Макрофагите бяха трансфектирани с имитатори на miR-384-5p, антисенс за miR-384-5p (as-miR-384-5p) или нулеви контроли (RiboBio Co., Ltd., Гуанджоу, Гуангдонг, Китай), като се използва реагент Lipofectamine 2000 ( Invitrogen), съгласно инструкциите на производителя. Ефективността на трансфекцията е близо 100%.

Анализ на апоптозата и поточна цитометрия

Култивираните клетки се суспендират отново при плътност 10 6 клетки/ml в PBS. След двойно оцветяване с FITC-анексин V и пропидиев йодид (PI) от FITC анексин V комплект за откриване на апоптоза I (Becton-Dickinson Biosciences, Сан Хосе, Калифорния, САЩ), клетките бяха анализирани с помощта на проточен цитометър FACScan (Becton-Dickinson Biosciences) за определяне на анексин V + PI-апоптотични клетки, със софтуер Flowjo (Flowjo LLC, Ashland, OR, USA). За анализи и изолиране на F4/80 + клетки, аортата се дисоциира с 10 μg/ml трипсин (Sigma-Aldrich) и 10 μg/ml DNase (Roche, Nutley, NJ, USA) за 35 минути. След филтриране при 30 μm, единичните клетъчни усвоявания от аортата на мишката се инкубират с PE-cy7-F4/80 (Becton-Dickinson Biosciences, Сан Хосе, Калифорния, САЩ) и след това се сортират на FACScan поточен цитометър.

RT-PCR в реално време

Аортна интимна РНК е изолирана от миши аорти. След почистване с ледено студен PBS, мишите аорти се промиват с TRIzol реагент (Invitrogen) с помощта на инсулинова спринцовка и елуатът се събира в епруветка от 1,5 ml и се подготвя за екстракция на РНК. Общата РНК се извлича от тъкан или култивирани клетки с miRNeasy мини комплект (Qiagen, Hilden, Германия). Комплементарната ДНК (cDNA) беше произволно грундирана от 2 μg обща РНК, използвайки комплект за обратна транскрипция на cDNA с голям капацитет (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). Впоследствие RT-qPCR се извършва в три екземпляра с QuantiTect SYBR Green PCR Kit (Qiagen). Всички грундове са закупени от Qiagen. Данните бяха събрани и анализирани с помощта на 2-ΔΔCt метод за количествено определяне на относителните нива на експресия на иРНК. Стойностите на гените първо се нормализират спрямо α-тубулин и след това се сравняват с експерименталните контроли.

Уестърн блотинг

Клетките се лизират с RIPA буфер, съдържащ протеаза и фосфатазни инхибитори (cOmplete ULTRA Tablets, Roche, Nutley, NJ, USA). След центрофугиране супернатантата се събира и определя количествено. След това протеините се разделят чрез SDS-PAGE и се прехвърлят в нитроцелулозни мембрани. След блокиране с 5% обезмаслено мляко, мембраните се сондират със заешки анти-p62, заешки анти-LC3, заешки-анти-Beclin-1, заешки-анти-ATG7 и заешки-анти-α-тубулин (клетъчна сигнална технология, Danvers, MA, САЩ). Вторичните антитела са HRP-конюгирани срещу плъх или заек (Jackson ImmunoResearch Labs, West Grove, PA, USA). Нивата на протеини първо се нормализират до α-тубулин и след това се нормализират към експерименталните контроли. Денситометрията на Western blots е количествено определена със софтуера NIH ImageJ.