Магдалена Котаньска

1 Катедра по фармакодинамика, Фармацевтичен факултет, Медицински колеж на Ягелонския университет, Краков, Полша

Йоана Śniecikowska

2 Катедра по медицинска химия, Фармацевтичен факултет, Медицински колеж на Ягелонския университет, Краков, Полша

Магдалена Ястрембска-Виенсек

3 Катедра по клинична фармация, Фармацевтичен факултет, Медицински колеж на Ягелонския университет, Краков, Полша

Марчин Колачковски

2 Катедра по медицинска химия, Фармацевтичен факултет, Медицински колеж на Ягелонския университет, Краков, Полша

4 Adamed Ltd., Pieńków, Полша

Каролина Пютка

1 Катедра по фармакодинамика, Фармацевтичен факултет, Медицински колеж на Ягелонския университет, Краков, Полша

Резюме

Въведение

Разпределението на серотонергичните 5-НТ6 рецептори в централната нервна система включва хипоталамусните области, които играят важна роля за апетита, приема на храна и контрола на телесното тегло (Heal et al., 2008). Проучванията показват, че 5-НТ6 рецепторните лиганди могат да имат активност срещу затлъстяване (Woolley et al., 2001; Heal et al., 2008; Karila et al., 2015). 5-НТ6 рецепторните антагонисти (т.е. PRX-07034, Ro 04-6790, BVT 5182, SB 271046) намаляват приема на храна чрез повишаване на ситостта и причиняват дълбока загуба на тегло при различни модели на затлъстяване при гризачи (Heal et al., 2008; Karila et al., 2015). Интересното е, че Fisas et al. (2006) демонстрира ефект срещу затлъстяването на E-6837 - частичен 5-НТ6 рецепторен агонист. Съединението причинява значителна хипофагия при плъхове със затлъстяване и диета, предизвикани от диета (Fisas et al., 2006; Heal et al., 2008).

Допаминовият транспортер остава потенциална цел за антагонистични или антагонистични заместителни терапии за злоупотреба със стимуланти, както и затлъстяване (Schmitt and Reith, 2010; Reith et al., 2015). Агонистите на допаминовите рецептори намаляват повишените нива на орексигенния невропептид и невропептид Y в хипоталамуса и нормализират хиперфагията, наддаването на телесно тегло и хипергликемията, наблюдавани при затлъстели ob/ob мишки (Bina and Cincotta, 2000). Повишените извънклетъчни нива на допамин (причинени от инхибиране на допаминовия транспортер) отчасти отчитат хипофагичните и термогенни ефекти на бупропион - инхибитор на допамин и норадреналин. Освен това Liu et al. (2004) доказаха, че D1/D2 рецепторната блокада значително атенюира индуцираната от бупропион термогенеза.

Повишените нива на допамин могат да повлияят на кръвното налягане (Volkow et al., 2003) и висцералните заболявания (Takeda et al., 1993). Хипертонията често се наблюдава при пациенти, лекувани с допаминови и норадреналинови инхибитори, като бупропион (Cunningham и Wiviott, 2014) и тезофеназин (Appel et al., 2014). Освен това, често срещаните нежелани реакции, свързани с налтрексон/бупропион, включват гадене, повръщане (Makowski et al., 2011).

EMD386088 е представен за първи път от Mattsson et al. (2005) като 5-HT6 рецепторен агонист (EC50 = 1.0 nM), показващ селективност спрямо други 5-HT рецептори, с изключение на 5-HT3. Той също така няма афинитет към α1, α2, β1, D2, D3, GABAA, опиоидни μ рецептори и 5-HT транспортер (Jastrzebska-Wiesek et al., 2013). Въпреки умерения афинитет, EMD386088 не действа нито като агонист, нито като антагонист на серотонинов 5-НТ3 рецептор в биофункционални проучвания (Jastrzebska-Wiesek et al., 2014). Последните in vitro проучвания демонстрират, че EMD386088 се държи като мощен частичен агонист на 5-НТ6 рецептора (Jastrzebska-Wiesek et al., 2013). EMD386088 също значително блокира транспортера на допамин (Jastrzebska-Wiesek et al., 2016).

Интересният фармакологичен профил на EMD386088 показва, че такъв тип съединение може да бъде от полза при лечението на затлъстяване. Следователно, в настоящото проучване имахме за цел да оценим влиянието на EMD386088 върху телесното тегло, приема на храна и метаболитните нарушения в модела на затлъстяване, предизвикан от диета с високо съдържание на мазнини, и модел на прекомерно хранене при плъхове. Също така определихме потенциала на съединението да индуцира повръщане и влиянието му върху кръвното налягане.

Материали и методи

Животни

Експериментите са проведени върху мъжки плъхове Wistar. Първоначалното телесно тегло е: 140–160 g: модел на затлъстяване, 190–220 g: модел на прекомерно хранене или 190–220 g: плъхове, при които моделите на затлъстяване или прекомерно хранене не са индуцирани. Животните бяха настанени по двойки в пластмасови клетки в помещения с постоянна температура, изложени на цикъл светлина-тъмнина; вода и храна са били налични по желание. Контролната и експерименталната групи се състоят от по шест до осем животни. Всички експерименти са проведени в съответствие с насоките на Комитета за употреба и грижи за животните на Ягелонския университет и са одобрени за реализация (2013 и 2015 г., Полша; Разрешения № 136/2013 и 258/2015).

Лекарства и съединения

Хепаринът е доставен от Polfa Warszawa S.A. (Варшава, Полша), докато тиопентал натрий и кетопрофен са от Sandoz GmbH (Австрия), кетамин и ксилазин от Biowet Puławy (Полша), а цефуроксим от Polfarma S.A. (Полша). EMD 386088 (Фигура (Фигура 1) 1) е синтезиран в Катедрата по фармацевтична химия, Фармацевтичен факултет, Медицински колеж на Ягелонския университет, Краков, Полша. Избрахме две дози EMD 386088 (т.е. 2,5 и 5 mg/kg) въз основа на нашите предишни експерименти (Jastrzebska-Wiesek et al., 2016).

ползи

Химична структура на изпитваното съединение: EMD 386088.

Затлъстяването, предизвикано от диета с високо съдържание на мазнини и влияние върху телесното тегло

Мъжки плъхове Wistar са били настанявани по двойки и хранени с високомаслена диета, състояща се от 40% маслена смес (Labofeed B с 40% свинска мас, Morawski, Manufacturer Feed, Полша) в продължение на 14 седмици, с налична вода ad libitum (Dudek et al., 2015, 2016). Контролните плъхове са хранени със стандартна диета (Labofeed B, Morawski Manufacturer Feed, Полша). След 10 седмици плъхове със затлъстяване, индуцирано чрез диетата им, бяха разделени на случаен принцип на три равни групи, които имаха еднакво средно телесно тегло и бяха третирани интраперитонеално с тествани съединения при следните дози: 2,5 или 5 mg/kg телесно тегло/ден и контролна група: превозно средство - вода 0,3 ml/kg (диета с високо съдържание на мазнини + превозно средство = група за контрол на затлъстяването) веднъж на ден сутрин между 9:00 и 10:00 сутринта в продължение на 21 дни. Контролните плъхове се поддържат на стандартна диета през 21 дни, с интраперитонеално приложение на носител - вода (стандартна диета + носител = контролна група). Приемът на храна и вода се измерва три пъти седмично, непосредствено преди приложението на лекарства. Животните винаги имаха свободен достъп до храна и вода. На 22-ия ден, 20 минути след интраперитонеално приложение на хепарин 1000 j/плъх и тиопентал (70 mg/kg телесно тегло) се събира плазма от животни.

Състав на фуражите с високо съдържание на мазнини (932 g суха маса): протеини - 193 g, мазнини (свинска мас) - 408 g, фибри - 28,1 g, сурова пепел - 43,6 g, калций - 9,43 g, фосфор - 5,99 g, натрий - 1,76 g, захар - 76 g, магнезий - 1,72 g, калий - 7,62 g, манган - 48,7 mg, йод - 0,216 mg, мед - 10,8 mg, желязо - 125 mg, цинк - 61,3 mg, кобалт - 0,253 mg, селен - 0,304 mg, витамин А — 15000 единици, витамин D3—1000 единици, витамин Е — 95,3 mg, витамин K3—3,0 mg, витамин B1—8,06 mg, витамин B2—6,47 mg, витамин B6—10,3 mg, витамин B12—0,051 mg, фолиева киселина - 2,05 mg, никотинова киселина - 73,8 mg, пантотенова киселина - 19,4 mg, холин - 1578 mg.

Диетата с високо съдържание на мазнини съдържа 100 g фураж - 550 kcal.

Ефектът на EMD 386088 върху телесното тегло и приема на храна и вода от не-затлъстели плъхове, хранени с вкусна диета (модел на прекомерно хранене)

За да се определи аноректичната активност на EMD 386088, беше оценен ефектът му върху приема на калории и вода в модела на прекомерно хранене. Мъжките плъхове Wistar (190–220 g) бяха настанени по двойки. Две групи от 6 плъхове бяха хранени с диети, състоящи се от млечен шоколад с ядки, сирене, осолени фъстъци и 7% кондензирано мляко и също имаха достъп до стандартни фуражи (Labofeed B, Morawski Manufacturer Feed, Полша) и вода ad libitum в продължение на 3 седмици. Изпитната контролна група (вкусна диета + носител) получи носител (вода, интраперитонеално), докато вкусната тестова група (вкусна диета + EMD 386088) беше инжектирана (интраперитонеално) с EMD 386088 в доза 5 mg/kg телесно тегло. разтворени във вода. Приемът на храна и вода се оценяват три пъти седмично, а телесното тегло се измерва ежедневно непосредствено преди приложението на лекарства. На 22-ия ден, 20 минути след интраперитонеално приложение на хепарин 1000 j/плъх и тиопентал (70 mg/kg телесно тегло) се събира плазма от животни.

Вкусна диета, съдържаща: 100 g фъстъци - 614 kcal; 100 ml кондензирано мляко - 131 kcal; 100 г млечен шоколад с лешници — 195 ккал; 100 г сирене (гръцки тип) —270 ккал.

Стандартната диета съдържа 100 g фураж - 280 kcal.

Ефектът на EMD 386088 върху телесното тегло и приема на храна и вода от плъхове без затлъстяване, хранени само със стандартна диета

Мъжките плъхове Wistar (190–220 g) бяха настанени по двойки. Контролната група (стандартна диета + носител) получи носител (вода, интраперитонеално), докато тестовата група (стандартна диета + EMD 386088) беше инжектирана (интраперитонеално) с EMD 386088 в доза 5 mg/kg телесно тегло. разтворени във вода. Приемът на храна и вода се оценява три пъти седмично и телесното тегло се измерва ежедневно непосредствено преди приложението на лекарства.

Влияние на EMD 386088 върху нивото на глюкозата в плазмата

За определяне на нивото на глюкозата в плазмата са използвани стандартни ензимни и спектрофотометрични тестове (Biomaxima S.A. Lublin, Полша). Субстратът се разлага с ензими, подходящи за съответния продукт, който се превръща в оцветено съединение. Оцветяването е пропорционално на концентрацията. Абсорбцията се измерва при дължина на вълната 500 nm.

Влияние на EMD 386088 върху нивото на глицерол при индуцирани от диета плъхове със затлъстяване

За определяне на нивото на глицерол в плазмата са използвани Glycerol Colorimetric Assay Kits (Cayman, САЩ).

Ефекти на EMD 386088 върху висцерално заболяване чрез измерване на приема на каолин (поведение на пика)

За да се изключи възможността потискането на приема на храна от EMD 386088 да е причинено от висцерално заболяване, поведението на пика беше оценено след приложение. Продължителността на теста беше 5 дни. В допълнение към безплатния достъп до фуражи, животните имаха безплатен достъп до белия каолин. През първите няколко дни животните бяха свикнали с присъствието на каолин в клетките си. На четвъртия ден им се дава интраперитонеално EMD 386088 при 5 mg/kg телесно тегло. или носител (отрицателна контролна група) или разтвор на CuSO4 в доза 6 mg/kg телесно тегло. (1/3 LD50; LD50 = 18 mg/kg за плъх при този начин на приложение; положителна контролна група). Количеството на одобрената консумирана храна, вода и каолин се определя след 24 часа. Също така, животните се претеглят преди приложение на съединението и след 24 часа.

Определяне на ефекта на EMD 386088 върху кръвното налягане по време на 22-часово проучване при плъхове wistar, живеещи в естествени условия на отглеждане - телеметричен метод

Кръвното налягане на плъхове, лекувани с EMD 386088, е измерено по време на 22-часов период след 5 mg/kg телесно тегло, интраперитонеално лечение със специална телеметрична система - Stellar (TSE-Systems, Германия; Dudek et al., 2016).

Операция: Операцията е извършена в продължение на 30 минути при стерилни условия. Плъховете се упояват с кетомин и ксилазин (интрамускулно инжектиране: 100 и 10 mg/kg). Преди операцията и в продължение на 7 дни след това животните бяха допълнително лекувани с цефуроксим (20 mg/kg/ден) чрез интрамускулно инжектиране и кетопрофен (5 mg/kg/ден) чрез интраперитонеално инжектиране. Кръвният поток в коремната аорта е блокиран временно и е поставен върхът на предавател за измерване на налягането. Предавателят е пришит към перитонеалната кухина.

Плъховете са отделени в клетки в продължение на 2 седмици, за да се излекуват след хирургично рязане. След това животните бяха поставени по двойки в клетки, за да се намали изолационният им стрес. Измерва се кръвното налягане: преди интраперитонеално приложение на съединенията - време 0 минути и 22 часа след това.

Статистически анализ

Статистическите изчисления бяха извършени с помощта на програмата GraphPad Prism 6. Резултатите са дадени като средно аритметично със стандартна грешка на средната стойност. Статистическата значимост беше изчислена с помощта на t-тест на Student (ако бяха сравнени две групи), еднопосочен ANOVA с тест за многократно сравнение на Dunnett post-hoc (биохимични експерименти), двупосочен ANOVA с тест Bonferroni post-hoc (експерименти in vivo). Разликите се считат за статистически значими при: p ≤ 0,05.

Резултати

Влияние на тестваните съединения върху телесното тегло и приема на калории и вода от затлъстели плъхове

EMD 386088, прилаган интраперитонеално в доза 5 mg/kg телесно тегло. на плъхове, хранени с високо съдържание на мазнини, причинява значително намаляване на наддаването на телесно тегло в сравнение със затлъстелите плъхове (контролна група за затлъстяване). Резултатите са показани на фигура Фигура 2А. 2А. Нямаше съществен ефект по отношение на намаляване на телесното тегло, когато тестваното съединение се прилага интраперитонеално в доза от 2,5 mg/kg телесно тегло. EMD 386088, прилаган интраперитонеално в доза 5 mg/kg телесно тегло. намалява количеството калории, консумирани от животните в тестовата група, в сравнение с контролната група за затлъстяване (Фигури 3А, В). EMD 386088, прилаган интраперитонеално в дози от 2,5 и 5 mg/kg телесно тегло. намалява приема на вода в тестовата група в сравнение с контролната група за затлъстяване (Фигура (Фигура 3С). 3С). Тъй като дозата 2,5 mg/kg е неактивна за намаляване на телесното тегло и приема на калории, ние използвахме само 5 mg/kg в следващите експерименти.

Подобно на приема на калории, животните, хранени с вкусен фураж и третирани с EMD 386088, показват значително по-малко наддаване на тегло, отколкото животните от контролната група, консумиращи преференциална храна (Фигура (Фигура 2В). 2В). От седмия ден на експеримента имаше статистически значима разлика между групите. Разликата в теглото на седем дни възлиза на 5,02%, а на двадесет и първия ден на 16,09%. Най-важното е, че телесното тегло на плъхове, третирани с EMD 386088 и имащи достъп до преференциални фуражи, не се различава съществено от теглото на контролните животни, хранени със стандартен фураж. Не са отбелязани ефекти върху телесното тегло при животни, лекувани с EMD 386088 и консумиращи стандартна храна. Резултатите са показани на фигура Фигура 2C 2C .

Няма значителни разлики по отношение на приема на вода от животни в групи, хранени с преференциални фуражи и групи, хранени със стандартни фуражи. Резултатите са показани на фигури 3F, I .