Резюме

Заден план

Разстройството от аутистичния спектър (ASD) все още се диагностицира чрез поведенческо наблюдение, поради липсата на лабораторни биомаркери, които биха могли да помогнат значително на клиницистите при предоставяне на по-ранни и по-надеждни диагнози. Метаболомиката върху човешки биофлуиди предоставя чувствителен инструмент за идентифициране на метаболитните профили, потенциално използваеми като биомаркери за ASD. Първоначалните метаболомични проучвания, анализиращи урината и плазмата на ASD и контролни индивиди, предполагат, че пациентите с аутизъм могат да споделят някои метаболитни аномалии, въпреки няколкото несъответствия, произтичащи от разликите в технологията, етническата принадлежност, възрастовия диапазон и дефиницията на „контролния“ статус.

Методи

Специфичните за ASD уринарни метаболомични модели са изследвани в ранна възраст при 30 деца с ASD и 30 съвпадащи контроли (възрастови граници 2–7, M: F = 22: 8), като се използва хидрофилна взаимодействаща хроматография (HILIC) -UHPLC и масспектрометрия, силно изразена чувствителен, точен и безпристрастен подход. След това метаболитите се подлагат на многовариатен статистически анализ и се групират по метаболитен път.

Резултати

Метаболитите в урината, показващи най-големи разлики между младите ASD и контролните деца, принадлежат към метаболитните пътища на триптофана и пурините. Също така витамин В6, рибофлавин, биосинтез на фенилаланин-тирозин-триптофан, пантотенат и CoA и метаболизмът на пиримидин се различават значително. Децата с ASD трансформират за предпочитане триптофана в ксантурена киселина и хинолинова киселина (два катаболита на кинурениновия път), за сметка на кинуреновата киселина и особено на мелатонина. Също така, чревният микробиом допринася за променен метаболизъм на триптофана, като води до повишени нива на индолил 3-оцетна киселина и индолил лактат.

Заключения

Метаболитните пътища, които са най-отличителни за младите италиански деца с аутизъм, до голяма степен се припокриват с тези, открити в моделите на ASD при гризачи след имунно активиране на майката или генетични манипулации. Тези резултати са в съответствие с предложението за реакция на пуриновата клетъчна опасност, придружена от свръхпродукция на епилептогенна и екситотоксична хинолинова киселина, големи намаления в синтеза на мелатонин и дисбиоза на червата. Тези метаболитни аномалии могат да бъдат в основата на няколко съпътстващи заболявания, често свързани с ASD, като припадъци, нарушения на съня и стомашно-чревни симптоми и могат да допринесат за тежестта на аутизма. Тяхната диагностична чувствителност, специфичност към заболяването и междуетническа вариабилност ще заслужават допълнително проучване.

Заден план

Разстройството от аутистичния спектър (ASD) представлява силно хетерогенна колекция от състояния на невроразвитието, характеризиращи се със социални и комуникационни дефицити, стереотипни и твърди модели на поведение, ограничени интереси и необичайна сензорна обработка с начало в ранна детска възраст [1]. Разпространението на аутизма се е увеличило значително през последните две десетилетия от 2–5/10 000 на 1:68 деца [2, 3]. Промените в диагностичните критерии и повишеното внимание от страна на медицинската общност със сигурност са допринесли за тази тенденция [4]. Също така е доказано, че увеличаването на възрастта на родителите при зачеването носи риск от ASD [5], както и някои фактори на околната среда, активни особено през критични периоди в пренаталното/ранното постнатално невроразвитие [6]. И накрая, генетичната податливост играе видна роля в патогенезата на ASD чрез сложни и хетерогенни основи, вариращи от редки варианти, снабдени с пълна проникновеност, до общи варианти, всеки от които обяснява много малки пропорции от общата фенотипна вариация, самостоятелно или чрез взаимодействия ген-среда [7, 8].

Въпреки значителния напредък в нашето разбиране за патофизиологията на ASD, това ниво на сложност и междуиндивидуална хетерогенност до голяма степен възпрепятства превеждането на научните знания в по-ефективни клинични практики. ASD все още се диагностицира изключително чрез наблюдение, стандартизирани поведенчески скали и интервюта с родители; траекториите на развитие на децата с ASD се наблюдават периодично, но не могат да бъдат надеждно прогнозирани, особено в ранна възраст. Чувствителните и специфични количествени биомаркери, измерими чрез лаборатория, образна диагностика на мозъка и/или електрофизиологични техники, биха могли да помогнат значително на клиницистите при предоставяне на по-ранни диагнози, по-навременни препратки към програми за поведенческа интервенция и прогностични прогнози, основани на факти [9].

Вземайки предвид тези методологични проблеми, за да увеличим вероятността за надеждно откриване на различия в метаболитните модели на урината, ние се фокусирахме върху аутистични и несвързани типично развиващи се деца на възраст 2–8 години, които съвпадат по възраст, пол, италиански произход и град на произход в рамките на страната [20]. За да осигурим широко покритие за откриване на метаболити върху проби от урина, които съдържат молекули, генерирани както от човешки клетки, така и от чревния микробиом, използвахме хидрофилна взаимодействаща хроматография (HILIC) -LC-йонизация на електроспрей (ESI) -MS, технология, особено подходяща за отделяне на прости и сложни смеси от въглехидрати, аминокиселини, гликозиди и други естествени полярни продукти в биологични течности, като човешка урина и плазма [26, 27]. Прилагайки този експериментален подход, бе установено, че метаболитите в пикочните пътища, най-съществено отличаващи аутистите от типично развиващите се деца, основно попадат в метаболитните пътища на триптофана и пурините.

Методи

Субекти

Тридесет деца с идиопатична ASD и тридесет типично развиващи се контроли бяха наети в Централна и Северна Италия. Те представляват по-голямата част от 64 случая и контроли на възраст 3–7 години, оценени за урина стр-крезол в предишното ни проучване [20]. Техните демографски и клинични характеристики са обобщени в Допълнителен файл 1: Таблица S1. Диагностичните оценки и медицинският скрининг са описани по-рано [20] (вижте също Допълнителен файл 2 с допълнителни методи). Тясното съвпадение на пола и възрастта (± 1 година) беше приложено за набиране на типично развиващи се деца, лишени от явна симптоматика на ASD сред потомството на клиничен/академичен персонал [20]. Средната възраст (± SEM) на случаите и контролите е съответно 4,83 ± 0,30 и 5,03 ± 0,32 години (Student’s т = -0,459, 58 df, P = 0,648, n.s.), а съотношението M: F е 22: 8. Всички случаи и контроли бяха от италиански произход и съпоставени по географски район или град на произход.

Събиране на урина и извличане на метаболит

Урините за първа сутрин се събират у дома от родители с помощта на стерилни контейнери, необработени с консерванти и се доставят във всеки клиничен център същата сутрин в мокър лед. След това пробите от урина бяха замразени, транспортирани в сух лед и съхранявани при -80 ° C непрекъснато до анализ.

Специфичното тегло на урината е измерено чрез рефрактометрия след центрофугиране при 13 000ж за 10 минути) с използване на цифров рефрактометър (Euromex Clinical Digital Refractometer RD.5712, NL), предварително калибриран с вода клас LC-MS.

Аликвотни части на урината (200 μl) се смесват с 200 μl метанол: ацетонитрил: вода (50:30:20), разбъркват се за 30 минути при максимална скорост при 4 ° C и след това се центрофугират при 16 000ж за 15 минути при 4 ° С. Супернатантите бяха събрани за метаболомен анализ. Контролът на качеството (QC) се получава от обединена смес от 10 μl аликвотни части от всички проби от урина и се анализира на всеки 15 проби.

HILIC-UHPLC

Разделянето на метаболитите се извършва, както е описано по-горе [28], чрез хидрофилна взаимодействаща хроматография (HILIC), използвайки Ultimate 3000 HPLC система с бърза разделителна способност (Dionex, Сънивейл, Калифорния), включваща двоична помпа и вакуумен дегазатор, автопломер с шест плочи порт микро-превключващ клапан и термостатирано отделение за колона. Колона Phenomenex Luna 3 μm HILIC 200 A (150 × 2.0 mm), защитена с предпазна колона HILIC 4 × 2.0 mm ID (Phenomenex, Torrance, CA), беше използвана за извършване на разделяне на метаболита през фаза B до фаза A градиент с продължителност 35 минути За разделяне на HILIC, подвижната фаза „А“ се състои от 50 mM амониев ацетат, смесен с ацетонитрил (95: 5, v/v), докато елуентът „В“ е съставен от смес от 50 mM амониев ацетат: вода плюс ацетонитрил (95: 5, v/v). Ацетонитрил, мравчена киселина и HPLC-вода са закупени от Sigma-Aldrich (Сейнт Луис, Мисури).

Масова спектрометрия

MS анализът е извършен върху електроспрей хибриден квадруполен инструмент за време на полет MicroTOF-Q (Bruker-Daltonik, Бремен, Германия), оборудван с източник на йони ESI, както е описано по-горе [29]. Масспектрите за проби, извлечени от метаболит, са получени както в положителен, така и в отрицателен йон; са показани само данни, произведени в отрицателен режим, тъй като по-мощни при анализиране на проби от урина. ESI капилярното напрежение е зададено на 4500 V (-) йон режим. Течният пулверизатор е настроен на 27 psi и азотният сушилен газ е настроен на скорост на потока 6 L/min. Температурата на сухите газове се поддържа на 200 ° С. Данните се съхраняват в режим на центроид и се събират със съхранен масов обхват 50–1200 м/z. Калибрирането на инструмента се извършва външно всеки ден с 10 mM натриев хидроксид в 50% изопропанол: вода, 0,1% мравчена киселина. Автоматизираното вътрешно калибриране на скалата на масата се извършва чрез директно автоматизирано инжектиране на разтвора за калибриране в началото и в края на всеки цикъл от отклонителен клапан с шест отвора.

Изработване на данни и статистически анализ

Данните се нормализират чрез специфично тегло в урината, тъй като отделянето на креатинин може да бъде необичайно намалено при деца с ASD [30]. Репликатите бяха експортирани като mzXML файлове и обработени чрез MAVEN.52 (достъпен на http://genomics-pubs.princeton.edu/mzroll/index.php?show=index) [31]. Масспектрометричните хроматограми бяха разработени за подравняване на пиковете, съвпадение и сравняване на родителски и фрагментни йони и предварителна идентификация на метаболита (в рамките на 10 ppm отклонение на масата между наблюдаваните и очакваните резултати спрямо импортираната база данни на Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG)) . Представителни примери за графика за определяне на масата и граници на фрагментация на MS/MS са представени за кинуренин, мелатонин и триптофан в Допълнителен файл 3: Фигура S1. Бяха извършени многовариантни статистически анализи върху целия набор от метаболомични данни, използвайки софтуера MetaboAnalyst 3.0 (http://www.metaboanalyst.ca) [32], който също така преглеждаше структурата на дисперсията на данните по неподдържан начин и създаваше разпръснати графики.

Ортогонален частичен анализ на най-малките квадрати (OPLS-DA), който определя предсказващ модел, който описва посоката на максималната ковариация между набор от данни (х) и членство в клас (Y.), след това се използва за увеличаване на разликата в метаболитните профили между случаите и контролите [33, 34]. OPLS-DA беше извършен с помощта на пакета за добавяне на Excel Multibase (Numerical Dynamics, Япония; http://www.numericaldynamics.com/) чрез прилагане на ортогонална корекция на сигнала върху метаболитните концентрации, изместени, log10 трансформирани, центрирани и мащабирани до единица отклонение.

Ефективността на оптималния модел беше тествана чрез анализ на кривата на работната характеристика на приемника (ROC) и набор от данни за валидиране, както се извършва с помощта на софтуера MetaboAnalyst 3.0 (http://www.metaboanalyst.ca) [32].

За контрастите на контрола на случаите на единични пикочни метаболити прагът на значимост се поддържа на номинална стойност P

Резултати

Уринарните метаболоми на младите аутисти и типично развиващите се деца се различават до голяма степен на триизмерния OPLS-DA парцел, изобразяващ първите три основни компонента (PC), които заедно обясняват 31,4% от общата дисперсия (фиг. 1; точност, Q2 и R2 данните са показани в Допълнителен файл 6). Получени са приблизително 10 000 пика на проба, отнасящи се до базата данни KEGG; сред тях 202 метаболита бяха анализирани по-точно и идентифицирани. Топ 25 на най-различаващите метаболити между случаите и контролите бяха допълнително дефинирани въз основа на „променливо влияние върху проекцията“ (VIP) резултати> 1 (Фиг. 2). ROC анализът, използвайки този набор от 25 метаболита, дава AUC = 0,893 (95% CI 0,72–0,96), както е показано в Допълнителен файл 7. „Преглед на метаболомите“, получен чрез анализ на метаболитните пътища (MetPA), показва метаболизма на триптофана, метаболизма на пурините, витамина B6 метаболизъм и фенилаланин-тирозин-триптофан биосинтеза като четирите най-нарушени метаболитни пътя при ASD (фиг. 3).

млади

OPLS-DA 3D графика, базирана на нормализирани и средноцентрирани данни. Всяка точка от данни представлява метаболома на един индивид. Някои точки от данни могат да се наслагват една върху друга

25-те най-дискриминиращи случая на метаболит ASD от контролите, класирани по променлива важност в проекционните (VIP) резултати и техния биохимичен път KEGG. VIP оценки> 1,0 се считат за значими

Парцел за анализ на метаболитния път. Интензивност на цвета (бял да се червен) отразява нарастващата статистическа значимост, докато диаметър на кръга ковари с въздействие на пътя. Графиката е получена с нанасяне върху оста y дневникът на стр стойности от анализа на обогатяването на пътя и на оста x стойностите на въздействието на пътя, получени от анализа на топологията на пътя

Предвид значимостта на получените от триптофан съединения за много невронни функции, метаболизмът на триптофана е оценен по-подробно на нивото на специфични междинни продукти (фиг. 4):

Кинурениновият път показва увеличение на ксантуреновата киселина и особено на хинолиновата киселина, успоредно със значително намаляване на кинуреновата киселина (Фиг. 4, път А).

Пътят на серотонина показва значително намаляване на мелатонина и неговия катаболит N-ацетил-5-метокситриптамин, които имат еднакво молекулно тегло и по този начин попадат под същия пик на MS (Фиг. 4, път В).

Бактериалното разграждане на триптофана дава в ASD, в сравнение с контролите, видимо по-големи концентрации на индоксил сулфат в урината и други производни на индол, включително индолил-3-оцетна киселина и особено индолил лактат (фиг. 4, пътища C и D).

Също така е установено, че пуриновият метаболизъм предава значителна дискриминационна сила, тъй като случаите на ASD показват по-високи концентрации в урината на много пуринови метаболити в сравнение с контролите, включително, наред с другото, инозин, хипоксантин и ксантозин (Фиг. 5).

Дискусия

Заключения