•  
  • Намерете този автор в Google Scholar
  • Намерете този автор в PubMed
  • Потърсете този автор на този сайт
  • Запис на ORCID за Jun Jiang
  • За кореспонденция: jiangjun_64 @ 163.comdoclan @ yeah.net

Резюме

Предназначение: Възпалителната инфилтрация играе важна роля както в канцерогенезата, така и в метастазите. Ние се интересуваме от разбирането на инхибиторния механизъм на метформин върху тумор-асоциирано възпаление при рак на простатата.

метформин

Експериментален дизайн: Чрез използване на трансгенен аденокарцином на миши модел на мишка (TRAMP), in vitro анализи за миграция на макрофаги и проби от пациенти, ние изследвахме ефекта на метформин върху свързано с тумора възпаление по време на започването и след андрогенна лишаваща терапия на рак на простатата.

Резултати: Лечението на TRAMP мишки с метформин забавя прогресията на рака на простатата от нискостепенна простатна интраепителна неоплазия до високостепенна ПИН, недиференцирана до добре диференцирана и ПИН към аденокарцином със съпътстващо инхибиране на възпалителна инфилтрация, доказано от намалено набиране на макрофаги. Освен това, метформинът е способен да инхибира следните процеси: възпалителна инфилтрация след андрогенна депривационна терапия (ADT), индуцирана от хирургична кастрация при мишки, лечение с бикалутамид при пациенти и лишаване от хормони в LNCaP клетки. Механично, метформин потиска възпалителната инфилтрация чрез понижаване на регулирането както на COX2, така и на PGE2 в туморните клетки.

Тази статия е представена в Акценти от този брой, стр. 5491

Транслационна релевантност

Предвид факта, че възпалителната инфилтрация обикновено се проявява при терапия с андрогенна депривация (ADT) и метформинът е способен да потисне прогресията на рака на простатата чрез инхибиране на инфилтрацията на тумор-асоциирани макрофаги, ние предлагаме, че комбинация от ADT с метформин може да бъде по-ефективна терапевтична стратегия при лечение на рак на простатата.

Въведение

Туморната микросреда (TME) е цялостното клетъчно обкръжение на туморни клетки, образувани от кръвоносни съдове, извънклетъчна матрица и някои немалигнени клетки, включително мезенхимни стволови/стромални клетки, получени от костния мозък дендритни клетки, фибробласти и имунни клетки (1). Тумор-асоциираните макрофаги (TAM), една от най-важните съставки на TME, се набират от туморни клетки и впоследствие се поляризират в M2-подобни клетки. Вместо да взаимодействат с антигените на раковите клетки и да унищожават раковите клетки, М2 макрофагите улесняват протуморигенната функция, като произвеждат цитокини като интерлевкини (IL4, IL6, IL10 и IL13) и TGFβ. Това в крайна сметка води до последващо разрушаване на околните тъкани и подобрява оцеляването, растежа, инвазията, миграцията и разпространението на туморни клетки (2). Множество доказателства показват, че TME играе решаваща роля не само в инициирането, прогресирането и метастазирането, но също така е замесен в развитието на терапевтична резистентност на различни видове рак (3, 4). В допълнение, стромалните клетки в TME се предлагат като привлекателна терапевтична цел и поради тяхната генетично стабилна характеристика, насочването към тези клетки обикновено е придружено с намален риск от резистентност и рецидив (5).

Трансгенният аденокарцином на мишката простата (TRAMP) служи като един от най-добрите in vivo животински модели на рак на простатата в продължение на много десетилетия. С експресията на вирусен онкопротеин SV40 в простатния епител (16), мишките развиват ПИН на възраст 10 до 12 седмици с рядък рак на простатата. Въпреки това, инвазивният аденокарцином на простатата обикновено се появява от 18 до 20 седмици и почти всички мишки TRAMP стават положителни за рак на простатата на възраст от 30 до 36 седмици, а някои от раковите клетки могат дори да метастазират в други органи като лимфни възли, бели дробове, черен дроб и кост (17). Въпреки че този животински модел има някои присъщи ограничения, тъй като вирусните антигени не са естествено свързани с рак на простатата при човека и дори с някаква обширна невроендокринна диференциация (18), той не само прилича на развитието и развитието на рак на простатата при човека (19), но е подходящ и за изучаване на развитие на резистентност към антиандрогенна терапия (20).

Материали и методи

Животни и експериментални процедури

Хистологичен анализ

Вентрални простални проби се събират от животни и се фиксират в 10% формалин за 24 часа и след това се влага парафин за хематоксилин и еозин (H&E). Слайдовете бяха заснети под светлинен микроскоп (Olympus, BX53). Хистологичната класификация на различни степени на простатни лезии при мишки TRAMP се основава частично на описания, направени от Roy-Burman P (20). Хистологичните характеристики са класифицирани съгласно следните спецификации: (i) Нормална тъкан (NT); (ii) ПИН с нисък клас (LGPIN); (iii) висококачествен ПИН (HGPIN); (iv) добре диференциран аденокарцином (WD-Adeno); и (v) недиференциран аденокарцином (UD-Adeno). Проведен е количествен анализ, както е описано по-рано с някои незначителни модификации (28). Накратко, за всяко животно бяха уловени 10 произволни полета с 10-кратно увеличение, което беше допълнително разделено на 4 квадранта. Във всеки квадрант най-модерната хистологична характеристика беше класифицирана като нормална, LGPIN, HGPIN, WD-Adeno или UD-Adeno. По този начин се установява броят на всеки подтип лезии във всяка експериментална група и процентите на различните подтипове лезии се сравняват между различните експериментални групи.

Пациенти и тъканни проби

Имунохистохимично оцветяване

Вградените туморни проби бяха нарязани и монтирани върху стъклени стъкла, последвани от имунооцветяване, както е описано по-горе (21, 29). Първични антитела срещу AR (1: 200, Abcam), KI67 (1: 200, клетъчно сигнализиране), CD68 (1: 200, Abcam), CD163 (1: 150, Origene), CD204 (1: 150, Origene), COX2 (1: 400 Origene), синаптофизин (1: 400, Proteintech) и CD56 (1: 600, Proteintech) бяха използвани. Интензивността на оцветяването се оценява от сертифицирани клинични патолози (д-р Qiang Ma и Hualiang Xiao), както е описано по-рано (30–32). За отбелязване е, че резултатите от възпалителни маркери (CD68, CD163 и CD204) са получени чрез преброяване на положителните клетки на площ (30). Накратко, 10 произволни или 3 представителни полета (съответно за микрочипове на човешка тъкан и миши тъкани) бяха уловени при увеличение 40 пъти. Преброени са положително оцветените клетки във всяко изображение. Резултатите от IHC за AR и COX2 са изчислени чрез умножаване на резултатите от интензивността с степента на оцветяване (31). Измерването на Ki67 беше прегледано с помощта на IHC снимки при увеличение 40 ×. Накратко, 10 произволни полета, съдържащи туморни епителни клетки, всяка мишка бяха уловени с увеличение 40 пъти и индексът на етикетиране беше оценен от двама сертифицирани патолози (32). IHC са снимани под светлинен микроскоп (Olympus, BX53).

Имунофлуоресцентно оцветяване

Имунофлуоресцентни оцветявания за CD68/CD163, CD163/CD204, CD68/CD204 и CD68/CD163/CD204 бяха проведени върху фиксирани с формалин, вложени в парафин секции. Срезите бяха инкубирани с първични антитела срещу CD68 (заек, Abcam, 1: 100), CD163 (мишка, Origene, 1: 100) и CD204 (коза, Abcam, 1: 2000). Вторични антитела, използвани за откриване, са заешки антитела срещу кози, конюгирани с флуоресцеин изотиоцианат (FITC, 1: 200, DINGGUO CHANGSHENG BIOTECHNOLOGY, Пекин, Китай), кози антитела срещу мишки, конюгирани с Alexa Flour 594 (1: 200, Zhongshan Gold Bridge Biotechnology ), кози антитела срещу заек, конюгирани с Alexa Fluor 647 (1: 200, Affinity Biosciences). Срезите бяха оцветени с DAPI в продължение на 15 минути (KGA215, KeyGen BioTECH) при 37 ° C и изображенията бяха получени с конфокална микроскопия (LSM700; Zeiss).

Анализ на клетъчна култура и жизнеспособност (MTT или CCK8)

Клетъчни линии (LNCaP, PC-3, DU145, THP1, RAW264.7, RM-1 и WPMY-1) са получени от Cell Bank на Шанхайски институти за биологични науки (Китайска академия на науките). Тези клетки се култивират при 5% СО2 и 37 ° С в съответната среда съгласно ATCC. Тестовете за жизнеспособност бяха проведени с багрило 3- (4, 5-диметилтиазол-2-ил) -2, 5-дифенил тетразолиев бромид (MTT) (5 mg/ml, Sigma) или комплект за броене на клетки-8 (CCK8). Плътността на разтворения формазан е отчетена при 490 nm спектрофотометрично (Bio-Rad).

Анализ за набиране на макрофаги

Раковите клетки на простатата се третират, както е посочено, и се събират кондиционираните среди (СМ) или контролната среда, разредени с 10% среда от пресен фетален говежди серум (FBS) (1: 1), поставени в долната камера на трансуелкови плочи с 5 -мм пореста поликарбонатна мембранна вложка (Corning). THP1 (1 × 105) или RAW264.7 (1 × 105) клетки се поставят в горната камера за анализ на миграция на макрофаги. Мигриралите клетки се събират от долната среда и се броят или оцветяват с кристално виолетово и се броят пет произволно избрани изгледа. Всеки експеримент се повтаря най-малко три пъти.

Анализ на клетъчна инвазия и миграция

Ракът на простатата/клетките на макрофагите се култивират в 24-ямкови плаки за трансплантация. Клетките се третират, както е посочено, и CM или контролната среда се събират, разреждат се с 10% прясна FBS среда (1: 1) и се поставят в долните 24-ямкови плаки; и раковите клетки на простатата (LNCaP, 1 × 105; RM-1, 3 × 104) бяха поставени в горните трансулуверни камери (Corning) със или без матригел. След инкубация при 37 ° С в продължение на 48 часа, клетките, прикрепени към горната повърхност на мембраната, бяха внимателно отстранени с памучни тампони, докато клетките, които достигнаха долната страна на камерата, бяха фиксирани с 10% формалин и оцветени с кристално виолетово за 3 минути при стайна температура и се отчита. Всеки експеримент се повтаря най-малко два пъти.

Уестърн блотинг

LNCaP и RM-1 клетки се посяват в 6-ямкови плаки, 2 х 105 клетки/ямка, третирани с различни концентрации на метформин (0, 1, 5, 10, 20 mmol/L). Клетъчните лизати се разделят на SDS-PAGE, последвано от Western blot анализ, както е описано по-горе (23, 33) със следните първични антитела: COX2 (1: 1,000, Origene) и β-актин (1: 5000, Cell Signaling).

Ензимно-свързан имуносорбентен анализ (ELISA)

Както е описано по-горе (29), LNCaP, RM-1 и RAW264.7 клетки се посяват в 6-ямкови плаки и серумът се гладува за 24 часа. Посочените концентрации на метформин се добавят към средата и се култивират в продължение на 48 часа. Супернатантата се събира и простагландин Е2 (PGE2) или IL6 и TNFα, освободени в хранителната среда, се измерват, като се използват търговски налични ELISA комплекти от Cloud-clone corp.

Нокаутиране на COX-2 чрез siRNA

Последователностите на siRNA срещу човешки COX2 са както е описано по-горе (29). И последователностите на siRNA срещу COX2 на мишка са получени от Shanghai Genechem Co., Ltd (Китай). За siCOX2-1: сензорен олиго 5′-UAC CCG GAC UGG AUU CUA UTT-3 ′, антисмислен олиго 5′-AUA GAA UCC AGU CCG GGU ATT-3 ′; за siCOX2-2: сензорен олиго 5′-GCC AUG GAG UGG ACU UAA ATT-3 ′, антисмислен олиго 5′-UUU AAG UCC ACU CCA UGG CTT-3 ′; и за siCOX2-3: сензорен олиго 5′-GAG CAC CAU UCU CCU UGA ATT-3 ′, антисмислен олиго 5′-UUC AAG GAG AAU GGU GCU CTT-3 ′. Раковите клетки на простатата се посяват при 80% сливане в 6-ямкови плаки и се гладуват със серумна депривация в продължение на 24 часа преди трансфекцията. За трансфекция се добавят 5 μL lipo2000 в разредена siRNA и сместа се добавя към средата. Клетките бяха трансфектирани в продължение на 48 часа и клетъчните лизати бяха използвани за Western blot, а средата беше използвана за анализи на миграция на макрофаги.

Клетъчен цикъл и апоптоза

Клетките PC-3, DU145 или WPMY-1 се посяват в 75-сантиметрови колби и серумът се гладува за 24 часа. Метформин се добавя към културата до крайни концентрации от 0, 1, 5, 10 и 20 mmol/L и се инкубира в продължение на 24 часа. Клетките се промиват със студен PBS три пъти, ресуспендират се в 70% етанол за анализ на разпределението на клетъчния цикъл или директно свързващ буфер от Анексин V, използван за анализ на апоптоза.

Статистически анализ

GraphPad Prism 5.0 е използван за всички статистически анализи. Данните бяха представени като средни стойности ± SD. Ако данните следват нормално разпределение, статистическата значимост на разликите между две групи данни се анализира чрез t тест и χ 2 тест, а разликите между няколко групи се анализират чрез еднопосочен дисперсионен анализ, последван от процедура за най-малко значима разлика за сравнение на средствата. За тези, които не отговарят на нормалното разпределение, бяха използвани непараметрични статистически тестове. Стойността на P по-малка от 0,05 се счита за статистически значима.

Резултати

Ефекти на метформин върху развитието на рак на простатата и метастази

Метформин инхибира възпалителната инфилтрация по време на развитието на рак на простатата