Медицински отдел, Институт Каролинска, Университетска болница Каролинска Худинге, Стокхолм, Швеция, Катедра по биология и хранене, Институт Каролинска, Университетска болница Каролинска Худинге, Стокхолм, Швеция

показват

Отделение за лабораторна медицина, Институт Karolinska, Университетска болница Karolinska Huddinge, Стокхолм, Швеция

Медицински отдел, Институт Karolinska, Университетска болница Karolinska Huddinge, Стокхолм, Швеция, Катедра по биология и хранене, Karolinska Institute, Karolinska University Hospital Huddinge, Стокхолм, Швеция

  • Илва Бонде,
  • Гьоста Егерцен,
  • Матс Ръдлинг

Фигури

Резюме

Високото ендогенно производство на или лечение с мурихолови жлъчни киселини силно намалява абсорбцията на холестерол. Следователно мишките, богати на мурихолни жлъчни киселини, могат да покажат повишена устойчивост срещу индуцирано от храната наддаване на тегло, стеатоза и непоносимост към глюкоза поради очаквано общо намаляване на абсорбцията на липиди. За да се провери тази хипотеза, мишките с дефицит на стероидна 12-алфа хидроксилаза (Cyp8b1 -/-) и следователно изобилие от мурихолови киселини са били наблюдавани в продължение на 11 седмици, докато са били хранени с високо съдържание на мазнини. Определя се приемът на храна и телесното и чернодробното тегло и се измерват липидите в черния дроб, серума и изпражненията. Освен това бяха оценени отговорите по време на орални тестове за глюкоза и интраперитонеален инсулинов толеранс.

По време на диетата с високо съдържание на мазнини мишките Cyp8b1 -/- показаха по-малко наддаване на тегло в сравнение с дивите тинейджъри (Cyp8b1 +/+). В допълнение, уголемяването на черния дроб със стеатоза и повишаване на серумния LDL-холестерол бяха силно отслабени при мишки Cyp8b1 -/- на диета с високо съдържание на мазнини. Фекалната екскреция на холестерол е повишена и има силна тенденция за удвоена фекална екскреция на свободни мастни киселини, докато екскрецията на триглицериди е непроменена, което показва намалена липидна абсорбция. При диета с високо съдържание на мазнини, мишките Cyp8b1 -/- също показаха по-ниски нива на серумна глюкоза в отговор на орално измерване на глюкоза или на интраперитонеална инжекция на инсулин в сравнение с Cyp8b1 + /+ .

В заключение, след излагане на диета с високо съдържание на мазнини, мишките Cyp8b1 -/- са по-устойчиви срещу увеличаване на теглото, стеатоза и непоносимост към глюкоза, отколкото мишките Cyp8b1 +/+. Намалената липидна абсорбция отчасти може да обясни тези констатации. Като цяло резултатите показват, че мурихолните жлъчни киселини могат да бъдат полезни срещу метаболитния синдром.

Цитат: Bonde Y, Eggertsen G, Rudling M (2016) Мишките, изобилни в мирихоличните жлъчни киселини, показват устойчивост на индуцирана от диетата стеатоза, наддаване на тегло и нарушен метаболизъм на глюкозата. PLoS ONE 11 (1): e0147772. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0147772

Редактор: Джонатан Питърсън, Източен Тенеси държавен университет, САЩ

Получено: 14 октомври 2015 г .; Прието: 7 януари 2016 г .; Публикувано: 29 януари 2016 г.

Наличност на данни: Всички съответни данни са в хартията.

Финансиране: Тази работа беше подкрепена от http://www.vr.se, грант №. K2013-55X-15075-10-3, http://www.hjart-lungfonden.se, грант No. 20130518, http://www.diabetes.se/diabetesfonden, грант №. DIA 2014-064, http://www.cardiovascular.se, грант №. Не е приложимо и http://www.sll.se/, грант №. 20130327. Финансистите не са играли роля в дизайна на проучването, събирането и анализа на данни, решението за публикуване или подготовката на ръкописа.

Конкуриращи се интереси: Авторите са декларирали, че не съществуват конкуриращи се интереси.

Въведение

Материали и методи

Животни

В това проучване бяха използвани 10-11-месечни мишки Cyp8b1 -/- и техните котилаци Cyp8b1 +/+, инбредни, както е описано [6]. Общо 73 мишки бяха разделени в следните групи; Cyp8b1 +/+ мишки, хранени с обикновена мишка чау (wt chow; 8 женски и 10 мъжки), Cyp8b1 -/- мишки, хранени с обикновена миша чау (ko chow; 10 женски и 9 мъжки), мишки Cyp8b1 +/+, хранени с HFD (wt HFD; 8 женски и 10 мъжки), и Cyp8b1 -/- мишки, хранени с HFD (ko HFD; 9 женски и 9 мъжки). HFD е получен от Research Diets Inc. (D12492, New Brunswick, NJ) и съдържа 60 kcal% мазнини. Редовната чау мишка (RM3 (P), Special Diet Services, Scanbur, Стокхолм, Швеция) съдържаше 11 kcal% мазнини. Мишките се държат в контролирана от температура среда без патогени с 12-часов цикъл от светлина до тъмно с храна и вода ad libitum. Телесното тегло (индивидуални измервания) и приема на храна (групово) се проследяват ежеседмично.

Процедури с животни

След 9 седмици беше извършен орален тест за толерантност към глюкоза (OGTT) на 4-часови гладуващи мишки чрез орално изследване на глюкоза (1 g глюкоза/kg телесно тегло, G8769, Sigma-Aldrich, Сейнт Луис, МО). След 10 седмици беше извършен интраперитонеален тест за толерантност към инсулин (IITT) на 4h гладни мишки чрез прилагане на интраперитонеални инжекции на инсулин (0.75 U инсулин/kg телесно тегло, Actrapid Penfill, Novo Nordisk, Bagsvaerd, Дания). Кръвната глюкоза се изследва в кръвни проби, взети от върха на опашката, преди да се приложат глюкоза или инсулин (след 0 минути) и отново на 15, 30, 60 и 130 минути след приложението и се анализира с помощта на ACCU-CHEK Aviva и тест ленти (Roche, Mannheim, Германия). След 11 седмици лечение, кръвта се събира от гладни мишки на 4 часа чрез сърдечна пункция по време на анестезия с изофлуран, след което анестезираните мишки се умъртвяват чрез дислокация на шийката на матката. Събраните органи се претеглят и замразяват бързо в течен азот. Южният етичен комитет на Стокхолм одобри това изследване (Номер на одобрение S96-11).

Общ чернодробен холестерол

Чернодробните нива на общия холестерол се изследват в 20% хомогенати, приготвени от 0,3 g черен дроб за всеки индивид. 1 ml хлороформ: метанол 2: 1 и 0,1 ml 0,9% натриев хлорид се добавят към 20 μL хомогенат в дубликати, които се завихрят и оставят при стайна температура, за да се отделят за 1 час. Долната фаза се събира и се поставя в 60 ° С под поток от течен азот, за да се изпари, преди да се разтвори отново в 1 ml хлороформ: метанол 2: 1, от които 0,5 ml се събира, изпарява и 1 ml 0,5 M калиев хидроксид в етанол, добавен преди пробите да бъдат поставени в 70 ° С за 90 минути, за да се разтворят отново. След това се добавят 1 ml вода и 5 ml хексан и пробите се разклащат енергично преди да бъдат оставени на стайна температура, за да се отделят за 1 час. Горната фаза се събира и се поставя в 60 ° С под поток от течен азот, за да се изпари, преди да се силилира с пиридин/хексаметилдисилазан/хлоротриметилсилан (3: 2: 1, об/об/об), изпари се и се разтвори отново в 0,1 мл хексан. Пробите се анализират с помощта на газова хроматография-мас спектрометрия, като се използва 2Н7-холестерол като вътрешен стандарт. Общото съдържание на холестерол в черния дроб се изчислява за всеки индивид чрез умножаване на концентрацията на холестерол по чернодробната маса.

Общо чернодробна TG

Общите чернодробни нива на TG се анализират в хомогенати от 0,2 g черен дроб в 4 ml хлороформ: метанол 2: 1 за всеки индивид. Хомогенатите се центрофугират при 3500 rpm в продължение на 10 минути при стайна температура. Събират се 2 ml от супернатантата и се прибавят 0,8 ml 0,9% натриев хлорид, преди пробите да се центрофугират при 3500 rpm в продължение на 10 минути при стайна температура. 0.6 ml от долната фаза се събират на два пъти и се изпаряват преди добавянето на 0.6 ml метанол с 0.05% Tween 80 и се завихря. Пробите се обработват с ултразвук, поставят се при 50 ° С и се завихрят до разтваряне. Четец Tecan Infinite® M200 (Männedorf, Швейцария) и реагенти от Roche Diagnostics GmbH (Манхайм, Германия) бяха използвани за анализ на проби съгласно инструкциите на производителя. Общото съдържание на TG в черния дроб се изчислява за всеки индивид чрез умножаване на концентрацията на холестерол по чернодробната маса.

Липопротеинов холестерол

Липопротеиновият холестерол във VLDL, LDL и HDL липопротеинови фракции се измерва чрез бързодействаща течна хроматография [13], като се използват реагенти от Roche Diagnostics GmbH.

Серумен кампестерол

Нивата на серумен кампестерол се определят в дублирани проби, като се използва газова хроматография-масспектрометрия, както е описано [14] и се нормализират за нивата на серумния холестерол. Този растителен стерол служи като косвен маркер за усвояване на холестерола [15].

Свободни фекални мастни киселини, холестерол и триглицериди

Общ глюкагоноподобен пептид-1 (GLP-1)

Общите нива на глюкагон-подобен пептид-1 (GLP-1) са изследвани в дублирани серумни аликвотни части чрез електрохимилуминесцентен имуноанализ съгласно указанията на производителите (K150JVC-2, Meso Scale Discovery (MSD), Gaithersburg, MD) с помощта на SECTOR Imager 6000 инструмент (MSD).

статистически анализи

Данните показват средна стойност ± стандартна грешка на средната стойност (SEM). Значимостта на разликите между групите беше тествана чрез еднопосочна ANOVA, последвана от post-hoc сравнения съгласно теста на Tukey, използвайки софтуера GraphPad Prism (GraphPad Software Inc., Сан Диего, Калифорния). Значимостта на разликите между групите по отношение на фекалната екскреция на липиди беше тествана чрез t-тест.

Резултати

Мишките Cyp8b1 -/- на HFD показват подобрена защита срещу непоносимост към глюкоза

След 9 седмици хранене с чау или с HFD, един OGTT (фиг. 1А) показа, че мишките Cyp8b1 +/+ и Cyp8b1 -/-, хранени с чау, са еднакво толерантни към глюкозата, представена като площ под кривата (AUC) на фигура 1В, въпреки че имаше тенденция за по-ниски нива на глюкоза при мишки Cyp8b1 -/-. И при мишките Cyp8b1 +/+ и при Cyp8b1 -/-, хранени с HFD, толерансът към глюкозата е нарушен в сравнение със съответните им контроли, хранени с чау Това увреждане обаче е значително по-малко тежко при мишки Cyp8b1 -/- в сравнение с мишки Cyp8b1 +/+. IITT, извършен след 10 седмично лечение (фиг. 1С), показва, че хранените с чау мишки Cyp8b1 +/+ и Cyp8b1 -/- реагират еднакво добре на инсулин, представен като AUC на фигура 1D. HFD, захранван с Cyp8b1 +/+, показва нарушен отговор на инсулин в сравнение с контрола му, подаван с чау, докато отговорът на инсулин при мишки, хранени с HFD, с Cyp8b1 -/- не се различава от този на контрола, хранен с чау.

Нива на кръвната глюкоза в отговор на орален тест за толерантност към глюкоза (OGTT) (А) и площ под кривите (AUC) (Б). Нива на кръвната глюкоза в отговор на интраперитонеален тест за толерантност към инсулин (IITT) (° С), и като AUC (Д). Данните са показани като средна стойност ± SEM, n = 16 за всички групи. *** = p -/- мишки, хранени с HFD, са защитени срещу хепатомегалия и стеатоза и показват подобрени липопротеинови профили

Няма разлика в теглото на черния дроб между Cyp8b1 +/+ и Cyp8b1 -/- мишки, хранени с чау (фигура 2А). При мишки Cyp8b1 +/+, хранени с HFD, теглото на черния дроб се е увеличило с 43%, докато теглото на черния дроб при мишки, захранени с HFD от Cyp8b1 -/- е непроменено. Сравнението на чернодробното тегло между Cyp8b1 +/+ и Cyp8b1 -/- мишки, хранени с HFD, разкри, че черният дроб от последните е с 29% по-лек.

Тегло на черния дроб (А), чернодробен холестерол (Б) и чернодробни триглицериди (TG) (° С). Серумен холестерол при VLDL (° С), LDL (Д), и HDL (E) липопротеинови фракции. Данните са показани като средна стойност ± SEM, n = (18–19) за всички групи. *** = p +/+ и Cyp8b1 -/- мишки, хранени с чау (фигура 2В и 2С). При мишките Cyp8b1 +/+, хранени с HFD, съдържанието на холестерол и TG се увеличава съответно с 43% и 36%, докато непроменено при мишките Cyp8b1 -/-, хранени с HFD, в сравнение със съответните им контроли, хранени с чау. Всъщност, мишките Cyp8b1 -/- на HFD са имали 25% по-нисък холестерол и 27% по-ниско съдържание на TG от мишките Cyp8b1 +/+ на HFD. Нивата на LDL- и HDL-холестерол в серума не се различават между мишките, хранени с chow Cyp8b1 +/+ и Cyp8b1 -/-, докато основният VLDL-холестерол е бил с 36% по-нисък при мишките Cyp8b1 -/- (Фиг. 2D – 2F). При мишки Cyp8b1 +/+ на HFD, LDL- и HDL-холестеролът се повишават съответно с 225% и 71% в сравнение с контрола, подаван от чау. Също така при Cyp8b1 -/- мишките с HFD, LDL- и HDL-холестерол са били увеличени съответно 87% и 71%, в сравнение с контрола, подаван от чау. Въпреки това, LDL-холестеролът при мишки Cyp8b1 -/- на HFD е с 35% по-нисък, отколкото при мишки Cyp8b1 +/+ на HFD, докато нивата на HDL-холестерол са сходни.

Повишаването на телесното тегло и ефективността на храната са намалени при мишки Cyp8b1 -/- на HFD

Телесното тегло не се различава между мишките Cyp8b1 +/+ и Cyp8b1 -/- върху чау през целия експеримент (фиг. 3А и 3В), въпреки че Cyp8b1 -/- показва силна тенденция да бъде по-лека. Установено е значително повишено телесно тегло както при мишките Cyp8b1 +/+, така и при Cyp8b1 -/-, хранени с HFD, но наддаването на телесно тегло е с 30% по-ниско при мишките Cyp8b1 -/-, отколкото при мишките Cyp8b1 +/+, както е показано на фигура 3С. Приемът на храна е подобен при мишки, хранени с чау cyp8b1 +/+ и Cyp8b1 -/-, както и при мишки Cyp8b1 +/+ и Cyp8b1 -/- на HFD (Фигура 3D). HFD значително намалява количеството консумирана храна, но изчисленията на общия калориен прием показват, че приемът на калории е подобен на този на контролите, хранени с чау. Средната AUC на наддаване на телесно тегло, разделена на средната AUC на приема на храна (наричана ефективност на храната, фиг. 3Е), показва, че мишките Cyp8b1 -/- на HFD са по-малко ефективни при използване на консумираната храна за натрупване на телесно тегло, отколкото на Cyp8b1 +/+ мишки на HFD.

Телесно тегло (А) и площ под кривата (AUC) (Б). Стрелката обозначава времевата точка, в която за първи път е настъпила значителна разлика в телесното тегло между мишки Cyp8b1 -/- и Cyp8b1 +/+ на HFD и тази разлика се запазва през целия експеримент. Увеличаването на телесното тегло, показано като AUC (° С), прием на храна (Д) и хранителна ефективност (E). Където е посочено, данните са показани като средна стойност ± SEM, n = (17–19) за всички групи. *** = p -/- мишки

Екскрецията на фекален холестерол при мишки с HFD е била повече от удвоена при мишки Cyp8b1 -/- в сравнение с тази при мишки Cyp8b1 +/+ (Фигура 4А). В съответствие с това, серумните нива на кампестерол, често използвани за оценка на абсорбцията на холестерол в червата, бяха силно намалени при мишки Cyp8b1 -/- на HFD, с нива под границата на откриване (фиг. 4В). Също така фекалната екскреция на FFA се удвоява при мишки Cyp8b1 -/- на HFD, въпреки че не достига статистическа значимост. Фекалната екскреция на TGs е непроменена при мишки Cyp8b1 -/- на HFD в сравнение с мишки Cyp8b1 +/+ на HFD.

Фекална екскреция на FFAs, холестерол и триглицериди (А), серумни нива на кампестерол, маркер за усвояване на холестерола (Б), и нива на серумен глюкагон-подобен пептид-1 (GLP-1) (° С). Където е посочено, данните са показани като средна стойност ± SEM, n = (17–19) за всички групи. *** = p -/- мишки (Фиг. 4C). На HFD, нивата на GLP-1 бяха намалени с 37% при мишките Cyp8b1 -/- и имаше силна тенденция за намаляване на нивата на GLP-1 също при мишки Cyp8b1 +/+.

Дискусия

Няколко модела мишки, които са устойчиви на индуцирана от храната непоносимост към глюкоза [9–12], споделят фенотипни черти с мишки Cyp8b1 -/- напр. увеличен BA басейн, обогатен с MCA [3, 8]. Ние предположихме, че високите нива на MCAs могат да бъдат важни за резистентността срещу нарушен метаболизъм на глюкозата и че следователно мишките Cyp8b1 -/- също трябва да са устойчиви на глюкозна непоносимост. Проведени са проучвания върху жени и мъже и резултатите се базират на комбинираните данни, докато те продължават след отделен анализ. Данните за жените и мъжете са представени поотделно в таблици 1 и 2. За отбелязване е, че някои отговори на HFD са били дори по-изразени при мъжете, напр. отговор на IITT, чернодробно тегло и съдържание на чернодробни триглицериди.

Настоящото проучване показва, че мишките Cyp8b1 -/- имат подобрена устойчивост срещу индуцирано от диетата наддаване на тегло и към нарушен метаболизъм на глюкозата, когато са предизвикани с HFD, както е показано от подобрените нива на глюкоза в кръвта след OGTT и IITT (Фигура 1A-1D). Въпреки това не е имало разлики в нивата на кръвната захар на гладно между Cyp8b1 +/+ и Cyp8b1 -/- мишки на чау, въпреки че е имало постоянна тенденция за по-ниска кръвна глюкоза при мишки Cyp8b1 -/- на чау. Освен това, мишките Cyp8b1 -/- на HFD демонстрират силно подобрена устойчивост срещу уголемяване на черния дроб, в съответствие с констатацията, че те не натрупват холестерол или TG в черния си дроб, както мишките Cyp8b1 +/+ на HFD (фиг. 2A – 2C). Причината, поради която не е настъпило уголемяване на черния дроб при мишките Cyp8b1 -/-, е неясна. Това може да включва общо намаляване на усвояването на хранителните мазнини, но липсата на холева киселина и голямото изобилие на FXR антагонистични MCAs [16] също могат да играят роля, докато тези две условия намаляват експресията на FGF15 [17, 18]. Съобщава се за нормална експресия на FGF15 като решаваща за регенерацията на черния дроб [19].

Предполага се, че механизмът, поради който мишките без микроби са устойчиви на развитие на непоносимост към глюкоза, е свързан с отсъствието на микробиота. Настоящите резултати показват, че също мишките Cyp8b1 -/- са устойчиви на непоносимост към глюкоза, предполагат, че самото отсъствие на микробиота може да не е от ключово значение, подкрепяйки възможността променените нива и състав на BA да са важни, тъй като BAs регулират микробиотата [ 22]. По този начин оценките на микробния състав на мишки Cyp8b1 -/- са друг аспект, който трябва да се включи в бъдещи изследвания.

В обобщение, тези открития разкриват, че мишките Cyp8b1 -/- с BA група, богата на MCA, са защитени срещу развитието на няколко стигмати на метаболитния синдром, като наддаване на тегло в тялото и черния дроб, стеатоза, хиперхолестеролемия и инсулинова резистентност. Резултатите показват, че MCAs могат да имат терапевтичен потенциал за лечение на метаболитен синдром.

Благодарности

Благодарим на Ингела Арвидсон и Лисбет Бентин, Университетска болница Каролинска в Хъдинге, за експертна техническа помощ и Мати Яухианен, Университет в Хелзинки, за любезните съвети относно анализа на фекалните липиди.

Принос на автора

Замислени и проектирани експерименти: YB MR. Извършва експериментите: YB. Анализира данните: YB GE MR. Реактиви/материали/инструменти за анализ, допринесени: YB GE MR. Написа хартията: YB GE MR.