Диетичните синтетични емулгатори променят драстично чревната микробиота и насърчават възпалението и метаболитния синдром при модели на гризачи.

полярни

Полярните липиди са естествени емулгатори, широко използвани при формулирането на храни, главно от растителни източници.

Глобулите от млечна мазнина естествено съдържат полярни липиди, богати на сфингомиелин, което е показано в предклинични проучвания за намаляване на абсорбцията на холестерол в червата и подобряване на метаболизма на липидите поради естествения афинитет на сфингомиелина да образува комплекси с холестерол.

Наличните клинични проучвания за хранителни добавки с млечни полярни липиди са доста неубедителни по отношение на тяхното благоприятно въздействие върху човешкия липиден метаболизъм, докато яйчните полярни липиди или мазнини, лишени от полярни липиди, повишават липидните маркери на сърдечно-съдовия риск в тези проучвания.

Значение на това проучване

Какви са новите открития?

Четириседмичната добавка с млечни полярни липиди намалява значително няколко маркера на гладно и след хранене на липиди за кардиометаболитен риск при жени с наднормено тегло в менопауза с риск от сърдечно-съдови заболявания (ССЗ).

Механизмите на действие на млечните полярни липиди при хората са свързани с тяхната метаболитна съдба и въздействието в червата, чрез намаляване на получените от червата хиломикрони, абсорбцията на чревния холестерол чрез съвместна екскреция с неабсорбираната сфингомиелинова фракция и чрез увеличаване на конверсията на холестерол в копростанол от чревната микробиота.

Консумацията на полярни липиди с мляко не променя нито основната бактериална фила на чревната микробиота, нито профила на късоверижните мастни киселини.

Как може да се отрази на клиничната практика в обозримо бъдеще?

Предвид техния понижаващ ефект върху липидните сърдечно-съдови маркери при възрастни с наднормено тегло, изложени на риск от развитие на метаболитен синдром, млечните полярни липиди трябва да бъдат част от новите диетични стратегии за първична и вторична профилактика на ССЗ.

Допълнителното механистично проучване при пациенти с илеостомия предполага засилване от полярните липиди на млякото на екскрецията на чревния чревен холестерол, известно като новата цел на клиничните стратегии за подобряване на кардиометаболитния профил.

Настоящите открития демонстрират необходимостта от допълнително изследване на въздействието на полярните липиди на млякото върху маркерите за възпалителен сърдечно-съдов риск, както и техния потенциален ефект върху копростанолигенните бактерии и тяхната потенциална роля за възстановяване на чревната микробиота еубиоза при заболяване.

Въведение

Методи

Бяха проведени две клинични проучвания, включващи множество метаболитни изследвания и анализи; вижте повече подробности в онлайн допълнителни материали и методи.

Допълнителен материал

Клинични проучвания

Проучването за диетична интервенция (проучване VALOBAB-C) е многоцентрово двойно-сляпо рандомизирано проучване с паралелен групов дизайн при жени с наднормено тегло в постменопауза. Проучването за остра консумация на PL с мляко (проучване VALOBAB-D) е многоцентрово двойно-сляпо рандомизирано проучване с кръстосан дизайн при пациенти с илеостомия. Всички участници предоставиха предварително информирано писмено съгласие. Изпитванията бяха одобрени от етичната комисия и правните власти (вж. Допълнителни онлайн материали и методи), регистрирани на www.clinicaltrials.gov (NCT02099032, NCT02146339) и проведени в Центровете за изследване на човешкото хранене в Рона-Алпи (CRNH-RA; Лион) и на Оверн (CRNH-A; Клермон-Феран, Франция) съгласно френския закон.

Проучвания

Проба VALOBAB-C

Допълнителен материал

Влияние на 4-седмична интервенция с до 5 g мляко PL в крема сирене върху концентрациите на липидни CV маркери след хранене (проучване VALOBAB-C). Обяснение на панела (A) и кинетика на общия серумен C (B), серумния TAG (C), плазменото отношение ApoB/ApoA1 (D) и плазменото ApoB48 (E) преди (V1, пунктирана линия) и след (V2, пълна линия) дневната консумация на 100 g сирене със или без PL през 4 седмици. Данните са представени като средна стойност ± SEM. Pgroup и pposthoc са показани за 8-часовия период след хранене (линеен смесен модел, последван от post hoc анализи на ΔV2 − V1); ptimexgroup не беше значим. Размер на групата: контрол n = 18, 3 g-PL n = 18, 5 g-PL n = 20. Вижте също допълнителна онлайн фигура S1 за дизайна на проучването. Апо, аполипопротеин; С, холестерол; ССЗ, сърдечно-съдови заболявания; CV, сърдечно-съдови; PL, полярни липиди; TAG, триацилглицероли.

Стратифицирахме разпределението на групите в центъра и ги разпределихме на случаен принцип. Две посещения на метаболитни изследвания (на гладно и след хранене) бяха извършени в началото (V1) и в края (V2) на всяка диетична интервенция (състав на хранене: допълнителна онлайн таблица S2). Основният резултат е ефектът в продължение на 4 седмици от дневната консумация на мляко PL (една контролна група и две нарастващи дози) върху серумната концентрация на гладно от общия холестерол (C), определен като разликата между V1 и V2. 4-седмичният период на интервенция е избран в съответствие с предходните изпитвания, отчитащи здравните ефекти на млякото PL или мътеница14 15 26 и за да се проучат адекватно потенциалните промени в състава на микробиотата на червата, което се изследва най-вече при диетични интервенции> 3 седмици 27 28

Хипотезите, размерът на извадката и изчисленията на мощността (въз основа на холестерола на гладно) са представени в допълнителни онлайн материали и методи. По отношение на 8-часовата надлъжна серумна концентрация на общия C, ние оценихме действителната мощност за общ обем на пробата от 58 индивида да бъде> 0,999 въз основа на действителните средни концентрации и общ SD от 0,42 mM. Всички данни бяха анализирани.

Проба на VALOBAB-D

Доброволците извършиха три отделни дни метаболитни тестове, разделени от период на измиване (допълнителна онлайн фигура S2A). По време на всяко посещение се сервира различна закуска, включваща едно от трите тестени сирена (100 g/хранене) според рандомизирани последователности и стабилни изотопни проследяващи вещества (13 C-триолеин, 2 H-холестерол; онлайн допълнителна таблица S2). Основната хипотеза беше, че млякото PL в храната ще увеличи илеалния излив на SM (първичен резултат). Вторичната хипотеза беше, че това ще бъде свързано както с повишен илеален излив, така и с намалена абсорбция на холестерол (вж. Предварително дефинирани изследователски хипотези и изчисляване на размера на пробата в допълнителни онлайн материали и методи). Размерът на пробата се изчислява след отчетени концентрации на илеостомия SM на шест субекта, 29 като се приема неблагоприятна ситуация на паралелна групова конструкция и най-голяма вариабилност и се очаква кръстосаният дизайн да намали вариабилността на резултатите, като по този начин се подобри анализът на мощността.

Участници в проучването

В проучването VALOBAB-C бяха включени 58 допустими доброволци: 19 в контролната група, 19 в групата с 3 g-PL и 20 в групата с 5 g-PL. Те проследиха цялото проучване и техните данни бяха анализирани (допълнителна онлайн фигура S1B). В проучването VALOBAB-D предварителният скрининг на кандидати от храносмилателни хирурзи и гастроентеролози на местни университетски болници позволи да се свържат с 40 лица. В крайна сметка могат да бъдат наети само четирима доброволци (трудности при набирането на тази популация; неразширяем период на включване, като се има предвид срокът на годност на PL-съставките). Доброволците изпълниха целия протокол, бяха проследени и техните данни бяха анализирани (допълнителна онлайн фигура S2B). Допълнителните онлайн материали и методи посочват повече подробности (скрининг, критерии за включване/невключване).

Хранителен състав на крема сирене

Три пълномаслени крема сирена (0, 3 и 5 g-PL) бяха формулирани с идентични пропорции на макроелементи, замествайки TAG с мляко PL в обогатени продукти (вж. Онлайн допълнителна таблица S1), без да се променя количеството на общите липиди, протеини и въглехидрати. Съдържанието на SM в млякото е 0,8 тегл.% В сирене 3 g-PL и 1,3 тегл.% В сирене 5 g-PL. Съдържанието на холестерол е по-високо в обогатените с мляко сирена, обогатени с PL, тъй като SM естествено се свързва с холестерола в липидните салове в MFGM.30 Обратно, съдържанието на TAG е по-високо в контролното сирене в сравнение с 3 g-PL и 5 g-PL сирена до заместване на TAG в обогатени сирена. Тъй като диетичният PL (включително мътеница PL) 5 съдържа естествено повече мононенаситени мастни киселини и полиненаситени мастни киселини (PUFA) и по-малко наситени мастни киселини (SFA), частичното заместване на TAG с мляко PL в крема сирене предизвика относително увеличение на количеството PUFA в млечни продукти, обогатени с PL, свързани с относително намаляване на количеството SFA (допълнителна онлайн таблица S1).

Метаболитни изследвания и лабораторни анализи

Подробности са предоставени в допълнителните онлайн материали и методи за метаболитните изследвания, извършвани при всяко посещение (допълнителни онлайн фигури S1C и S2C) от VALOBAB-C (преди/след интервенция) и доброволците VALOBAB-D; анализът на VALOBAB-C на (i) циркулиращи клинични параметри (общ C, LDL-C, липопротеин с висока плътност (HDL) -холестерол (HDL-C), концентрации на TAG и глюкоза в серума, аполипопротеин (Apo) B и ApoA1 в плазма, серумен инсулин, плазмен ApoB48 и PCSK9; площ под изчислението на кривата (AUC), (ii) богати на хиломикрон фракции, получени от червата (CMRF) (липиди, хидродинамичен диаметър), (iii) изпражнения (фекални липиди, популационни нива на основните филогенетични групи и бактериални видове чревна микробиота, SCFA във фекална вода) и анализ VALOBAB-D на (i) илеален излив на SM и холестерол, (ii) количество и изотопно обогатяване на олеинова киселина в плазмата, на CO2 в издишан въздух и свободен холестерол в плазмата и CMRF, (iii) изчисление на екзогенно липидно окисление.

статистически анализи

В проучването VALOBAB-C описахме непрекъснатите променливи като средна стойност ± SEM (за разпределение, отклоняващо се от нормалността, медиана и IQR). Разликата между посещенията (V2-V1) беше използвана като променлива на отговора. Дизайнът на нашето проучване планираше да измерва всеки параметър надлъжно при всяко посещение (1–10 времеви точки). Освен параметрите на единична времева точка, които бяха анализирани чрез общ линеен модел и последващи post hoc тестове след теста на Tukey, ние извършихме смесено линейно моделиране, за да отчетем повтарящи се мерки в рамките на субекта, търсейки основни ефекти, т.е., поне „групов“ ефект, времеви ефект и взаимодействие. Последващите анализи бяха извършени след теста на Tukey-Kramer, за да се детайлизират основните ефекти и контрол за фамилна грешка от тип I. В случай на остатъчно разпределение, отклоняващо се от нормалността, се правят анализи върху ранговете. В допълнение, ние направихме всички тези анализи, разглеждайки глобалния ефект на „мляко PL“ като двоичен фактор, тоест, обединяване на дози от 3 g-PL и 5 g-PL в една група спрямо контрола. Анализите бяха извършени на SAS V.9.4 (SAS Institute, Cary, North Carolina, USA) с грешка от тип I, зададена на 0,05. Допълнителната онлайн таблица S3 обобщава броя на взетите проби за всеки анализ.

В проучването VALOBAB-D данните са представени като средни стойности ± SEM и са анализирани със софтуера GraphPad Prism 7. За нормално разпределени данни бяха извършени многократни измервания на дисперсионен анализ (ANOVA) (според храненето) или двупосочен ANOVA (според хранене и време), последвани от post hoc тест на Tukey. За ненормални данни беше извършен тест на Фридман, последван от post hoc тест на Dunn. За всеки параметър беше извършен тест на Mann-Whitney U за сравняване на контролното хранене с PL храненията, обединени заедно. Отчитат се номинални двустранни р стойности.

Резултати

Характеристики на субектите

В проучването VALOBAB-C доброволците са жени с наднормено тегло в постменопауза на сравнима средна възраст, без хипертриглицеридемия на гладно и диабет на гладно, но с риск от ССЗ с коремно затлъстяване, гранична висока стойност на гладно LDL-C и гранична ниска стойност на HDL-C на гладно (таблица 1). Доброволците също са имали нискостепенно възпаление със средно ниво на реактивен протеин С> 3 mg/L, което се счита за високорисково.31 Участниците в проучването VALOBAB-D са пациенти със затлъстяване и нормолипемична илеостомия (допълнителна онлайн таблица S4). Тази специфична популация е избрана за събиране на остатъчните неусвоени липиди в края на тънките черва (илеум), преди да достигнат дебелото черво.

Антропометрични и метаболитни характеристики на гладно на популацията от проучването VALOBAB-C при скрининг

Съответствие и хранителен прием в проучването VALOBAB-C

Средното съответствие с диетичната интервенция е високо (> 98%) и подобно между групите (p> 0,3). Хранителните записи, с изключение на изследваното крема сирене, показват, че доброволците от трите групи не са модифицирали диференцирано приема на енергия и макроелементи, нито прием на фибри, алкохол, холестерол и мастни киселини (FA) между V1 и V2 (допълнителна онлайн таблица S5).

Млякото PL намалява кръвните липиди на гладно и свързаните с тях кардиометаболични маркери на риска

Сравнихме ефектите от 4-седмичната интервенция между групите върху промяната (Δ) на стойностите между посещенията V2 и V1 (т.е. ΔV2-V1). Няколко маркера на гладно за кардиометаболитен риск бяха значително модифицирани от интервенцията (таблица 2). Общото С на гладно намалява значително в групата с 5 g-PL (pgroup Вижте тази таблица:

  • Преглед на линия
  • Преглед на изскачащия прозорец

Разлики в ефектите на 4-седмичната интервенция с мляко PL в крема сирене върху маркерите за метаболитен риск на гладно в проучването VALOBAB-C

25% от общото тегло на изпражненията).

Основни филогенетични групи и бактериални видове чревна микробиота след 4-седмична интервенция с до 5 g млечни полярни липиди (PL) в крема сирене в проучването VALOBAB-C. Вариации (log-fold промяна V2/V1) на изобилието на основните бактериални групи и видове, които са измерени като log 16S rDNA генни копия на g фекалии: (A) общо бактерии, (B) Firmicutes, (C) Bacteroides- Група Prevotella, (D) Akkermancia muciniphila, (E) Bifidobacterium spp, (F) група Lactobacillus-Leuconostoc-Pediococcus, (G) група Clostridium coccoides, (H) група Clostridium leptum, (I) Faecalibacterium prausnitzii, (J) Правоъгълна група Eubacterium, (K) Veillonella spp, (L) семейство Enterobacteriaceae, (M) Escherichia coli и (N) Bilophila wadworthia. Данните са посочени като медиана с IQR; се показва pgroup. Размер на групата: контрол n = 18, 3 g-PL n = 18, 5 g-PL n = 20.

Фекален профил на късоверижните мастни киселини преди (V1) и след (V2) 4-седмична интервенция с до 5 g/ден млечни полярни липиди (PL) в крема сирене в проучването VALOBAB-C. (A) Ацетат, пропионат и бутират, (B) изобутират, формиат, сукцинат и лактат. Данните са представени като средно ± SEM, pgroup са показани. NB: по отношение на общото количество основни късоверижни мастни киселини в (A), ацетат + пропионат + бутират: pgroup = 0,35. По технически причини анализи, извършени само в център 2, размер на пробата: контрол n = 8, 3 g-PL n = 7, 5 g-PL n = 8.

Млякото PL намалява абсорбцията на холестерол в червата и увеличава изтичането на холестерол-илеята при пациенти с илеостомия

Като се има предвид липсата на човешки механистични проучвания върху въздействието на диетичния PL върху абсорбцията на холестерол в червата, 3 извършихме пилотно следпрандиално проучване върху пациенти с илеостомия, използвайки маркери, златен стандартен подход.56 Подобните iAUC на серумните липиди и хиломикрон-липидите между правилата за хранене разлики в чернодробния клирънс на хиломикрон. По-ниският [2 H] -холестерол в CMRF показва, че млякото PL може да намали постпрандиалното включване на диетичния холестерол в хиломикроните при хората. Освен това, 8-часовият общ отлив на холестерол в илеята ((погълната фракция на холестерола, оставаща неабсорбирана от тънките черва) + (ендогенен холестерол, който не е реабсорбиран)) е значително увеличен след хранене с PL, което може да обясни по-ниските плазмени постпрандиални концентрации на [ 2 H] -холестерол с мляко PL. Предишни проучвания върху гризачи и in vitro съобщават, че диетичният SM може да намали абсорбцията на холестерол чрез образуване на непогълнати комплекси с холестерол.8 9 57 Тъй като тук 20% -25% от погълнатото мляко SM е установено непокътнато в илеалния излив, по-ниската абсорбция на холестерол може да бъде обяснена отчасти чрез взаимодействията си с неабсорбирано мляко SM в червата. Общият холестеролен илеален излив обаче след PL хранене (

1510–1750 mg) е дори два пъти по-голямо от очакваното чрез сумиране (контролен излив на холестерол) + (съдържание на холестерол в PL-хранене) (

750 mg). „Очевидно отрицателно усвояване“ на холестерол се съобщава и след интрадуоденална инфузия на лецитин (30 g/ден) при хора.58 Това предполага, че (i) неразграденото мляко SM също може да намали степента на реабсорбция на ендогенния холестерол на чревната лигавица и ( ii) млякото PL и/или SM може също така да подобри отделянето на холестерол през чревния тракт (TICE), т.е. повишена обратна абсорбция на ендогенен холестерол в тънките черва.59 При базови условия при леко хиперхолестеролемични мъже, TICE допринася за 35% от фекалиите неутрална екскреция на стерол.60 Следователно при жени с наднормено тегло от проучване VALOBAB-C, повишеният излив на холестерол в илеята може да допринесе за наблюдаваните хипохолестеролемични ефекти, както се потвърждава от проучването VALOBAB-D. Хипотезата за потенциалното участие на TICE подобрението заслужава допълнителни механистични изследвания при хората.

Трябва да се направят няколко нюанса: Резултатите от VALOBAB-C не могат да бъдат екстраполирани на лица с други метаболитни нарушения/заболявания (първична дислипидемия, пациенти с нормално тегло). Някои специфични и/или тромави анализи са извършени само върху ограничен брой субекти. По-нататъшните проучвания при мъже и при жени в менопауза и използване на дългосрочни интервенции сега могат да бъдат от особен интерес. Успоредно с PL, специфичното въздействие на протеините MFGM, които могат да генерират биоактивни пептиди в червата, не е оценено в настоящите проучвания и трябва да бъде изследвано в бъдещи изследвания. И накрая, характеризирането на чревната микробиота в настоящата работа беше извършено с помощта на целенасочен метагеномичен подход (16S rDNA секвениране) и бъдещите механистични проучвания трябва да включват подходи за метагеном на пушка.

Благодарности