Институт по нефрология, Народна болница NanJing LiShui

модел

Клон в болница Zhongda Lishui, Медицински факултет, Югоизточен университет

87 Dingjiaqiqoa, Нанкин (Китай)

Сродни статии за „“

  • Facebook
  • Twitter
  • LinkedIn
  • електронна поща

Резюме

Въведение

Ектопичната калцификация, включваща отлагане на кристали на калциев фосфат, е често усложнение на хроничното бъбречно заболяване (ХБН) и включва съдова калцификация [1], калцификация на клапата (VC) [2] и калцификация на кожата [3]. Съдовата калцификация и VC включват активен процес, при който съдовите гладкомускулни клетки или интерстициалната клетка на клапата претърпяват фенотипична трансформация в остеобластоподобни клетки, подобни в много отношения на костния метаболизъм [2, 4]. VC и съдовата калцификация са често срещани усложнения на ХБН и критични показатели за сърдечно-съдови заболявания (ССЗ) и смъртност от всички причини при пациенти с ХБН [5-7] или краен стадий на бъбречно заболяване [8]. Съгласно насоките, публикувани в Бъбречна болест: Подобряване на глобалните резултати (KIDGO), пациентите с ХБН с известна ВК са изложени на най-висок риск от ССЗ [9]. Честотата на VC се увеличава с прогресия на ХБН, като честотата е приблизително 40% при пациенти с ХБН в стадий 3 и 80–99% при пациенти с ХБН в стадий 5 [10-14]. Основните изследвания на ХБН обаче са предизвикателни поради липсата на подходящ изследователски модел.

В предишно проучване Shuvy et al. [15] използва диета с високо съдържание на аденин (0,75%) и високо съдържание на фосфати (НР) (1,5%) в продължение на 7 седмици, за да установи VC модел на аортата. Кратката продължителност на ВК очевидно не съвпада с продължителността на ВК, наблюдавана при пациенти с ХБН в клиниката, и бъбречната функция на този модел е възстановима. В допълнение, единичните сърдечни клапи обикновено не са засегнати, а аортните (45-59%) и митралните (34-55%) клапи са най-често засегнати [16]. Повечето съвременни изследвания се фокусират върху съдовата калцификация. В животинския модел на съдова калцификация на ХБН, съдържанието на съдов калций (Са) е повече от два пъти от това в нормалните кръвоносни съдове [17]. Следователно планирахме да установим стабилен уремичен модел, който е по-съвместим с клиничните находки при пациенти с бъбречна диализа и да оценим промените в аортната и митралната клапа.

Често използваните методи за ХБН включват хирургия (5/6 нефректомия, 5/6Nx) [18], електрокаутеризация [19] и индукция на лекарства (аденин [20], оксалат [21]). Добре установеният модел 5/6Nx, използван в нашата лаборатория, имитира човешка ХБН с повишени нива на серумен креатинин (Scr) [22] и тубулоинтерстициална фиброза [18]. След 5/6Nx, повишените нива на фосфат в диетата могат да предизвикат секреция на паратиреоиден хормон (PTH), което причинява нарушен метаболизъм на Ca и фосфор, който ускорява VC. Често използваните концентрации на фосфат в диетата са 1,2 [23] и 1,8% [24]. Наскоро разработихме модел на костни аномалии при плъхове, причинени от диета, съдържаща аденин и 1,8% фосфат [20]. В нашето проучване и други проучвания обаче не е имало очевиден ВК сред плъхове, хранени с 1,8% фосфатна диета, както е показано при изследване с микрокомпютърна томография (микро-КТ) [25]. Следователно, увеличаването на концентрацията на фосфат в диетата за 8 седмици може да предизвика VC. Клапните клетки експресират по-високи нива на противовъзпалителна иРНК, отколкото съдовите клетки [26], което показва, че 8-седмичната продължителност на HP диетата не е била достатъчна. Следователно трябва да определим оптималната концентрация на фосфат в НР диетата, прилагана за различно време.

Следователно, в това проучване ние изследвахме калцификация с много клапани в модел на плъхове с 5/6Nx и ХРН, хранени с HP. Това проучване има за цел да определи приноса на HP диета за дългосрочно калциране на много клапи за различен период от време в модел на ХБН, който е по-съвместим с клиничните находки при пациенти с бъбречна диализа, отколкото други модели с ХБН.

Методи

Животни

Осемседмични мъжки плъхове Sprague-Dawley (Лаборатория за животни на Университета в Нантонг, Китай) (н = 40) са хранени с нормална фосфатна (NP) диета (0,9% P и 1,0% Ca) (Нанкин, Китай) и са разделени на четири експериментални групи (фиг. 1): (A) фалшив + HP (н = 10); (B) бутафория + NP (н = 10); (C) 5/6Nx + HP (н = 20); и (D) 5/6Nx + NP (н = 10). Концентрациите на фосфор в чау, подаван на плъхове във всяка група, са 2.0, 0.9, 2.0 и 0.9%. Процедурата 5/6Nx беше извършена, както беше описано по-горе [18]. Всички животни са получили хуманни грижи, а протоколите от изследването са в съответствие с институционалните насоки.

Фиг. 1.

Разширение на паращитовидната жлеза на групата 5/6Nx + HP. а Общото представяне на паращитовидните жлези на групата 5/6Nx + HP. б Повишеното тегло на паращитовидната жлеза в групата 5/6Nx + HP в сравнение с тази в групата с фалшиви + HP. ° С Сравнение на HE оцветяване и експресия на PCNA между групите 5/6Nx + HP и фалшиви + HP.

Серумна биохимия

Азот на урея в кръвта (BUN), Scr, Ca, фосфор (P) и 24-часови нива на белтък в урината се измерват с полуавтоматичен биохимичен анализатор (ECA-2000A, Jilin, Китай) и UV-5100 спектрофотометър (Шанхай, Китай) . Нивата на серумния PTH се определят чрез ELISA (Abnova).

Хистология

За хистопатология на клапите клапите на плъховете бяха изолирани и внимателно отстранени със скалпел. Тъканните проби за хистологичен анализ бяха фиксирани в 10% фосфатно буфериран формалин. Тъканите бяха вградени в парафин, разрязани и оцветени с хематоксилин и еозин (HE), сафранин зелено, Alcian синьо и фон Kossa, съгласно стандартните методи [27].

Западно петно

Протеиновите проби се разделят чрез електрофореза на натриев додецил сулфат-полиакриламиден гел и след това полумокри се прехвърлят върху мембрани от поливинилиден флуорид. Неспецифичните места за свързване бяха блокирани с 5% говежди серумен албумин (BSA), разтворен в буфериран с Tris физиологичен разтвор, съдържащ 0,1% Tween 20 за 1 h при стайна температура (RT). Мембраните бяха инкубирани с първични антитела срещу Sox9 (ab185966) и α-актин (ab179467) в продължение на една нощ при 4 ° C. Конюгираните с пероксидаза вторични антитела се инкубират с мембраните за 1 h. Лентите бяха открити с помощта на хемилуминесцентен пероксидазен субстрат от хрян (Merck Millipore) със система за събиране на изображения ImageQuant LAS 4000.

Имунофлуоресцентно оцветяване

Криосекциите (5 μm) бяха фиксирани с 4% параформалдехид, проникнати с 0,25% Triton X-100 и блокирани с 5% BSA във фосфатно буфериран физиологичен разтвор при RT. След това предметните стъкла бяха имунооцветени с първичното антитяло срещу Sox9 (ab185966) при 4 ° С за една нощ. След инкубация с вторично антитяло в продължение на 1 час на тъмно при RT, изображенията бяха заснети с помощта на лазерно сканиращ конфокален микроскоп (LSM 710 META, Zeiss, Германия).

Имунохистохимия

Парафинизираните срезове се обезпаразитяват във вода, а обезпарафинираните, хидратирани тъканни участъци се обработват предварително с разтвор за извличане на антиген (рН 6.0). Секциите бяха инкубирани с 3% H2O2 в дейонизирана вода в продължение на 15 минути, за да се блокира ендогенната пероксидаза и изплакнати с PBS. Антитела срещу ICAM-1 (1: 400) и пролифериращ клетъчен ядрен антиген (PCNA) (ab92552, 1: 400) бяха добавени и срезовете бяха инкубирани една нощ при 4 ° С. Клетките бяха потопени в PBS и бе добавен Fag фрагмент на IgG антитяло-HRP полимер. След това сместа се инкубира в продължение на 30 минути при RT (37 ° С), последвано от промиване 5 пъти с PBS за по 3 минути. Цветът е разработен с помощта на DAB решение.

Ехокардиографска оценка на функцията на лявата камера

След хранене с HP диета в продължение на 16 седмици, плъховете се упояват чрез непрекъснато приложение на 2% изофлуран в 100% кислород при 2 L/min чрез маска за лице. След това се извършва трансторакална ехокардиография при всички плъхове, като се използва ултразвукова система (Vevo 2100, VisualSonics Inc., Торонто, ON, Канада) с 21-MHz сонда. Фракцията на изтласкване на лявата камера и фракционното скъсяване са изчислени, за да се оцени функцията на лявата камера. Измерванията в продължение на три последователни сърдечни цикъла бяха осреднени. При анализиране на аортния диаметър беше приет изглед на М-режим с дълга ос, а за определяне на градиента на скоростта и налягането в сърцето беше използвана доплер ехокардиография. Анализът на данните се извършва по заслепен начин.

Електронна микроскопия на клапанната микроструктура

Пресни и децелуларизирани проби от листовки на аортната клапа бяха фиксирани в смес от 2,5% глутаралдехид и 4% параформалдехид при pH 7,35 в продължение на 30 минути при RT за сканираща електронна микроскопия (SEM) (S-4800, Hitachi, оборудвана с енергийна дисперсионна спектроскопия [EDS ]) или трансмисионна електронна микроскопия (TEM) (HR-TEM, FEI Talos F200S, оборудвана с EDS). След фиксиране и дехидратация с етанол, пробите се вграждат в смола Durcupan за ултратънко сечение и ултрамикроскопско наблюдение. EDS се извършва с TEM и SEM, работещи при 200 kV, което осигурява пространствени разделителни способности съответно от 500 nm и 30 μm.

Рентгенова дифракция

Калцифицираните тъкани се анализират за фазови и кристализационни свойства с помощта на рентгенов прахообразен дифрактометър. Калцифицираната област на сърдечната клапа се отстранява под стереоскопски микроскоп, промива се три пъти с дестилирана вода и се суши с помощта на вакуумна система за лиофилизиране. Измерванията на праховата рентгенова дифракция (XRD) бяха направени на рентгенов дифрактометър Bruker D4 с излъчване Cu Kα при скорост на сканиране 0,05 (2θ) s –1 (λ = 0,15418 nm). Изсушеният прах се разпределя равномерно върху повърхността на предметното стъкло и се поставя на сцената на рентгенов дифрактометър на прах. Инструментът използва мед като мишена, с K-лъч (λ = 1,54 nm) като източник на лъчение, напрежение на тръбата от 40 kV, ток на тръбата от 35 mA и скорост на сканиране от 5 °/min; записана е крива на дифракционна интензивност 2θ 10∼90 °.

Статистически анализ

Всички резултати бяха изразени като средно ± стандартно отклонение. Ако данните съответстват на параметричния тест, тогава разликите между групите се сравняват с теста на Bonferroni за post hoc анализ след еднопосочен ANOVA тест. В противен случай е използван непараметричен тест (като тест с ранг-сума) за анализ от статистическия софтуер SPSS 21.0. Разлики с стр стойности