Визуален преглед

Резюме

Променената реабсорбция на глюкоза чрез улеснения глюкозен транспортер 2 (GLUT2) по време на диабет може да доведе до увреждане на бъбречните проксимални тубулни клетки (RPTC), възпаление и интерстициална фиброза. Тези патологии също се задействат чрез активиране на канабиноид-1 рецептора (CB1R), което допринася за развитието на диабетна нефропатия (DN). Връзката между CB1R и GLUT2 обаче предстои да бъде определена. Тук показваме, че хроничната периферна CB1R блокада или генетично инактивиращи CB1Rs в RPTC подобряват индуцираните от диабета бъбречни структурни и функционални промени, възпаление на бъбреците и тубулоинтерстициална фиброза при мишки. Инхибирането на CB1R също понижава регулирането на експресията на GLUT2, влияе върху динамичното преместване на GLUT2 към мембраната на четката на RPTCs и намалява реабсорбцията на глюкоза. По този начин, насочването към периферна CB1R или инхибирането на GLUT2 динамиката в RPTCs има потенциал за лечение и подобряване на DN. Тези открития могат да подкрепят обосновката за клиничното тестване на периферно ограничени CB1R антагонисти или разработването на нови специфични за бъбреците GLUT2 инхибитори срещу DN.

Захарният диабет, хронично заболяване, което сега достига епидемични размери, 1 е описано като катализатор за редица състояния, едно от които е диабетната нефропатия (DN). DN, характеризиращ се с намалена GFR, гломерулна и тубулна хипертрофия, албуминурия, бъбречно възпаление и тубулоинтерстициална фиброза, 2 е най-честата причина за повишена заболеваемост и смъртност при пациенти с диабет тип 1 и 2. 3 Следователно има критична необходимост от идентифициране на подходящи терапевтични цели и тестване на нови терапевтични стратегии за управление и облекчаване на DN.

Последните данни показват, че промените в транспорта на глюкоза чрез улеснения транспортер глюкозен транспортер 2 (GLUT2) по време на хипергликемия могат да повлияят отрицателно на бъбречната функция и свързаните тубулоинтерстициални промени, наблюдавани при DN. 4-8 GLUT2, локализиран в бъбречните проксимални тубуларни клетки (RPTC), обикновено засяга базолатералния излив на реабсорбираната или новосинтезирана глюкоза от тубуларната клетка обратно към циркулацията. 9,10 Експресията му в RPTC се увеличава драстично при хора с диабет 11, както и при миши модели на диабет и затлъстяване. 6,7,12 Освен това се съобщава и за промяна в локализацията му от базолатералната мембрана на RPTC (BLM) към мембраната на апикалната/четката (BBM), допринасяща за повишена реабсорбция на глюкоза. 6,13 Доказано е, че плазмените или луминалните концентрации на глюкоза регулират експресията и/или транслокацията на GLUT2, 10 отчитайки вредните ефекти на хипергликемията върху проксималните тубули. Въпреки че докладите относно транскрипционната регулация на GLUT2 разкриват няколко транскрипционни фактора, които могат директно да контролират експресията на GLUT2 при условия на диабет, 14-16 молекулярният механизъм нагоре по веригата, лежащ в основата на тези процеси, все още не е определен.

Ендоканабиноидите (eCBs), действащи чрез канабиноид-1 рецептора (CB1R), медиират вредните последици от DN. 17–22 Бъбречната експресия на CB1R се засилва при диабетични мишки, 18,22 и нейното генетично/фармакологично активиране увеличава протеинурията и дисфункцията на подоцитите, 23 докато нейната хронична блокада подобрява бъбречната функция. 18,20,24–26 Тъй като загрижеността относно неблагоприятните невропсихиатрични ефекти 27 ограничава терапевтичния потенциал на глобално действащите CB1R антагонисти, наскоро бяха разработени и предклинично тествани 28 периферно ограничени блокери. 29–33

Повишеният бъбречен eCB „тон“ по време на DN ни накара да предположим, че регулирането на GLUT2 в RPTCs може да се дължи на активирането на системата eCB/CB1R. Тук описваме нов клетъчен механизъм, чрез който CB1R регулира експресията и транслокацията на GLUT2 в RPTC. Нашите резултати показват, че индуцираното от диабет регулиране на бъбречната експресия и динамика на GLUT2 може да бъде смекчено чрез периферна блокада или генетична аблация на CB1R в RPTCs, за да се намали реабсорбцията на глюкоза и да се предотврати развитието на DN.

Резултати

Периферната блокада CB1R обръща бъбречната дисфункция, предизвикана от диабет

За сравнение на глобално действащи и периферно ограничени CB1R антагонисти при подобряване на DN, мишките с диабет се третират всеки ден в продължение на 16 седмици съответно или със SLV319, или с JD5037 (допълнителна фигура 1). Намалено наддаване на телесно тегло, приписвано на намалена обща мастна (но не и постна) телесна маса, е отбелязано във всички групи с диабет (Фигура 1, А-С). Както се очаква, нивата на серумна глюкоза бяха драстично регулирани, докато нивата на серумния инсулин и броят на островчетата Лангерханс бяха значително намалени (Фигура 1, D-F). В сравнение с третирани с носител (Veh) контролни мишки, които показват запазени кръгли до удължени островчета, диабетните животни показват малки, изкривени островчета, със значителна загуба на клетъчните си структури и подредба (Фигура 1G).

Оценката на вредния ефект на ACEA при hRPTCs разкри, че инкубирането на клетките само в присъствието на високи нива на глюкоза предизвиква значително повишаване на нивата на TNFα и IL-18 (Фигура 3, O-Q), които се подобряват чрез предварителна обработка на клетките с JD5037 (Фигура 3, P и Q). Активирането на CB1R при същите условия на диабет предизвика огромни увеличения в неговата генна експресия, както и в IL-18 и TNFα, ефекти, които бяха напълно отслабени от JD5037. Освен това, както активирането на CB1R, така и/или хипергликемичните състояния значително намаляват hRPTC жизнеспособността, докато предварителната обработка на hRPTCs с JD5037 го възстановява (Фигура 3R). Взети заедно, тези открития предполагат, че блокирането на CB1R има потенциала да инхибира трафика на глюкоза чрез RPTCs, като влияе на експресията на GLUT2 и следователно, подобрява увреждането на тубуларните клетки по време на диабет.

Периферната блокада CB1R намалява DN при диабетни мишки на Akita

Тъй като токсичността на стрептозотоцин (STZ) може да доведе до β-клетки на панкреаса, обхващащи различни органи, 36 като бъбреците, ние тествахме ефикасността на JD5037 в генетичен модел на мишка за DN 1 тип (Akita Ins2 +/C96Y). 37–39 Подобно на индуцирания от STZ диабет, хроничното лечение с JD5037 не спасява диабет при мишки Akita (Фигура 4, A – D). Докато съотношението на бъбреците към телесното тегло остава високо, нивата на глюкозата в урината са значително повишени, а съотношението на албумин към креатинин, както и нивата на BUN (Фигура 4, E-H) са намалени при лекувани с JD5037 мишки с диабет Akita. Освен това JD5037 намалява креатининовия клирънс и съотношението на потребление на вода към вода (Фигура 4, I и J), както и бъбречно увреждане, възпаление и тубулоинтерстициална фиброза (Фигура 4, K-M). Тези бъбречни подобрения, индуцирани от периферна CB1R блокада, са свързани с нормализиране на експресията на GLUT2 (Фигура 4, N-R) и PKC-β1 (Фигура 4, S-U).

Освен това, когато култивирахме MDCK II клетки в Matrigel, което позволява образуването на многоклетъчни бъбречни кисти с различни базолатерални (външни) и апикални (вътрешни) повърхности (допълнителна фигура 5), открихме, че кистите, култивирани в PBS, показват базолатерална локализация на GLUT2, който беше напълно пренасочен към апикалната повърхност на клетките, когато клетките бяха изложени на високи нива на глюкоза (Фигура 5, A и B) или се активираха с ACEA (Фигура 5, C и D). И двата ефекта са напълно инхибирани от JD5037.

Дискусия

Убедителните доказателства сочат, че хипергликемията е основен фактор, допринасящ за влошаването на бъбреците и развитието на DN. CB1R също играе ключова роля в патогенезата на DN, като подчертава потенциалния терапевтичен ефект от неговата блокада за подобряване на бъбречната функция по време на диабет. Това проучване показва за първи път, че CB1R в RPTCs регулира експресията на GLUT2 и неговата динамика и следователно може да повлияе на реабсорбцията на глюкоза по време на хипергликемия. Това допринася за клетъчно увреждане и следователно, поставя началото на тубулоинтерстициалната фиброза и DN. По този начин възникващото значение на CB1R за контролиране на проксималната тубулна GLUT2 физиология предполага, че манипулирането на CB1R и/или GLUT2 в RPTCs трябва да се разглежда като терапевтична стратегия за лечение на DN.

Използвайки няколко модела за DN, други са показали, че или фармакологична блокада, или генетичен нокаут на CB1R подобрява индуцираното от диабет бъбречно увреждане, възпаление, фиброза и клетъчна смърт. 17,18,23,25,26,42 Въпреки това, тъй като използването на глобално действащи CB1R инхибитори при хората е ограничено, 27 решихме да тестваме ефекта на наскоро разработения и добре характеризиран периферно ограничен CB1R антагонист 29 в тип 1 DN мишка модели. Въпреки че нито JD5037, нито SLV319 са спасили диабета при тези модели, при диабетичните мишки, лекувани с двата антагониста, са открити значителни подобрения в бъбречната функция и намаляване на възпалението и бъбречната фиброза, констатации, които са в добро съгласие с многобройни скорошни доклади. 17,18,25,42

Придружен от увеличената експресия на тубуларен GLUT2 при хипергликемия, се съобщава и за промяна в локализацията му от BLM към BBM. 6,13 Тук, чрез използване на дву- и триизмерно динамично проследяване на GLUT2 в MDKC II клетки, както и при мишки с диабет, открихме, че хипергликемията предизвиква апикално вмъкване на GLUT2 в BBM. Този ефект е имитиран чрез стимулиране на CB1R in vitro. И двата ефекта са притъпени от блокирането му с JD5037. Взети заедно, тези резултати допълнително сочат към участието на CB1R в регулирането на динамиката на GLUT2 по време на диабет.

Неотдавнашното клинично одобрение на SGLT2 инхибитори за лечение на хипергликемия при пациенти с диабет подчертава терапевтичния потенциал на инхибиране на GLUTs в бъбреците. Тестването на нивата на SGLT2 и във всичките четири животински модела, използвани в това проучване, не показва промени в неговата експресия след генетична делеция или фармакологична манипулация на CB1R. Важното е, че нивата на SGLT2 бяха намалени и при двата модела на диабет, както се съобщава от Albertoni Borghese et al. 47 (допълнителна фигура 11). Предполага се, че инхибиторите на SGLT2 могат да увеличат риска от АКИ поради високия неабсорбиран натрий и глюкоза, 48 и по този начин те не се препоръчват за пациенти с ниско АН, пациенти в напреднала възраст или пациенти с намалена бъбречна функция. Следователно, бъбречната блокада GLUT2 може да се разглежда като обещаваща стратегия за защита на бъбреците от развитието на DN.

В обобщение, това проучване показва, че CB1R блокадата обръща DN чрез регулиране на GLUT2 в RPTCs. Най-вероятният основен клетъчен механизъм, който свързва CB1R блокадата с GLUT2, е свързан с нарушаването на индуцираното от глюкоза Ca 2+ -зависимо PKC-β1 активиране, което от своя страна модулира транслокацията и/или експресията на GLUT2 в RPTCs (Фигура 8). Тъй като хипергликемията и CB1R могат да споделят подобна молекулярна сигнална каскада чрез стимулиране на Gq/11, блокирането на CB1R води до намалена експресия на GLUT2 в BBM, като позволява на по-малко молекули глюкоза да влязат в RPTC, което следователно предотвратява тяхната диабетна дисфункция.

Предложен механизъм за участие на CB1R в регулирането на индуцирана от хипергликемия транслокация на GLUT2 към BBM в RPTCs. (Горен панел) Високите нива на глюкоза предизвикват активирането на протеина CB1R-Gq/11, което води до освобождаване на вътреклетъчни запаси от калций от ендоплазмения ретикулум (ER). Повишеният калций активира PKC-β1, който медиира апикалната транслокация на GLUT2 и увеличеното навлизане на глюкоза от лумена на тубулите в RPTC, което води до тубулно увреждане и DN. (Долен панел) Фармакологичната блокада или генетичната делеция на CB1R в RPTCs води до намалено активиране на Gq/11-свързан протеин и следователно по-малко молекули глюкоза навлизат в RPTCs. Това от своя страна предпазва клетките от вредните ефекти на хипергликемията.

Кратки методи

Животни и експериментален протокол

Експерименталният протокол беше одобрен от Институционалния комитет за грижи и употреба на животните към Еврейския университет в Йерусалим. На мъжки 8-седмични мишки C57Bl/6 бяха приложени пет последователни интраперитонеални STZ инжекции (50 mg/kg на ден; протокол STZ с ниски дози). На контролна група се дава 0,1 mol/L цитратен буфер (рН 4,5). Индуцираните от STZ мишки с диабет се третират ежедневно с SLV319 (3 ​​mg/kg през устата), JD5037 (3 mg/kg през устата) или Veh (1% Tween80 и 4% DMSO във физиологичен разтвор) в продължение на 16 седмици и на контролите им се дава Veh . Подобен протокол беше реализиран при мъжки 8-седмични мишки RPTC-CB1R -/- 40 и техните контроли за отпадъци. За протокола STZ с висока доза 8-седмични мъжки мишки C57Bl/6 или RPTC-CB1R -/- и техните контроли получиха еднократна инжекция STZ (185 mg/kg интраперитонеално). Освен това, 7-седмични мъжки мишки с диабет Akita Ins2 +/C96Y са лекувани ежедневно с JD5037 (3 mg/kg перорално) или Veh в продължение на 7 седмици, а техните недиабетни контролни C57Bl/6 котила са третирани с Veh. След евтаназия се събира кръв от багажника и се отстраняват и претеглят бъбреците и панкреаса; пробите бяха или бързо замразени, или фиксирани в буфериран 4% формалин. Пълните методи са в допълнителен материал.

Материали

STZ, ACEA, 2-NBDG и цитохалазин В са закупени от Cayman Chemical. JD5037 и SLV319 са синтезирани, както е описано по-горе. 49

Биохимия

Серумният инсулин и урината албумин са измерени чрез ELISAs. BUN, глюкоза в урината и креатинин се определят с помощта на химически анализатор Cobas C-111. Липокалин 2 в урината, IP-10, цистатин С и клъстерин се определят чрез панели 1 и 2 Мултиплексни тестове за токсичност, използвайки Luminex MAGPIX. Нивата на KIM-1, TIMP-1 и LCN2 в урината са измерени чрез ELISA. Резултатите бяха нормализирани до общия креатинин в урината.

Хистопатология

Парафиновите 2-μm участъци на бъбреците и парафиновите 5-μm участъци на панкреаса от всяка група се оцветяват с периодична киселина-Шиф, последвано от оцветяване с хематоксилин. Изображенията на бъбреците са направени от десет случайни 40 × полета от всяко животно. За всеки бъбрек бяха уловени 20 произволно избрани гломерули и площите на напречното сечение на бъбреците бяха количествено определени с помощта на ZEN BLUE софтуер.

Имунохистохимия

Фиксираните бъбреци и панкреас са били вградени в парафин. Четири микрометров участък е подложен на имунооцветяване, както е описано по-горе. 40 Антитела са изброени в допълнителна таблица 1. Положителните области са количествено определени с помощта на ImageJ.

Западно петно

Анализите на Western blot за бъбречни хомогенати са проведени, както е описано по-горе. 50 антитела са изброени в допълнителна таблица 1.

PCR в реално време

Цялата бъбречна или клетъчна лизатна мРНК беше извлечена и анализите на генната експресия бяха оценени, както е описано по-горе. 51 Грундове са изброени в допълнителни таблици 2 и 3.

Клетъчна култура

hRPTCs и DhRPTCs (Lonza) бяха култивирани в среда REGM BulletKit, както е описано по-горе. 29 MDCK II клетки (ATCC), експресиращи С-крайния GLUT2-mCherry слет протеин, бяха култивирани, както е описано по-горе. 13

Калциеви изображения

hRPTCs и DhRPTCs бяха забелязани в камери за изображения с 0,2 mg/ml покрити с поли-лизин 3-4 часа преди да бъдат заредени с 10 μM Fura-2AM за 1 час. След това клетките се инкубират в d-глюкоза или ACEA в присъствие/отсъствие на 100 nM JD5037 в продължение на 30 минути. Клетките бяха осветени с ксенонова дъгова лампа.

Малко интерфериращо РНК лечение

Малка смущаваща трансфекция на РНК срещу GLUT2 (sc-35495; Santa Cruz) беше извършена в hRPTCs, използвайки системата на siRNA реагент (sc-45064; Santa Cruz) в съответствие с инструкциите на производителя.

2-NBDG анализ и поточна цитометрия

Всички експерименти с поточна цитометрия се провеждат в буфер без Na + хлорид Na +. hRPTCs бяха засяти в 12-ямкови плаки със/без 100 nM JD5037 за 30 минути или 10 μM цитохалазин В за 10 минути. След това клетките бяха инкубирани в продължение на 2 часа в присъствието/отсъствието на 100 μM 2-NBDG, разтворени в буфер без холин хлорид Na + с/без висока глюкоза (30 mM) или 10 μM ACEA.

XTT тест

Тестът за жизнеспособност на клетките XTT е извършен в съответствие с инструкциите на доставчика в шест независими експеримента.

Транслокация на клетъчен GLUT2

Монослойни и диференцирани кухи поляризирани кистозни култури на MDCK II клетки, експресиращи С-краен GLUT2-mCherry сливан протеин са установени, както е описано по-горе. 13

STZ измервания чрез течна хроматография-тандемна масова спектрометрия

STZ беше открит с помощта на мас спектрометър TSQ Quantum Access Max в режим на положителна йонизация, използвайки йонизация с електроспрей, а откриването и количественото определяне бяха извършени с помощта на множество реакции на мониторинг.

Статистически анализи

Стойностите се изразяват като средна стойност ± SEM. Несдвоеният двустранен t тест беше използван за определяне на разликите между групите. Резултатите в множество групи и зависими от времето променливи бяха сравнени от ANOVA, последвано от тест на Bonferroni (GraphPad Prism v6 за Windows). Значението беше определено на P Randall MD,

  • Кендъл DA,
  • O’Sullivan S

    • glut2

    : Сложността на сърдечно-съдовите действия на канабиноидите. Br J Pharmacol 142: 20 - 26, 2004 pmid: 15131000