Резюме

Заден план

Чемеринът, кодиран от гена на реагиращ на ретиноева киселина 2 (RARRES2) ген, е секретиран от адипоцит протеин с автокринни/паракринни функции в мастната тъкан, метаболизъм и възпаление с наскоро описана функция за регулиране на съдовия тонус, черен дроб, стеатоза и др. Тази молекула се смята да представлява критичен ендокринен сигнал, свързващ затлъстяването с диабета. Няма налични данни относно развитието на RARRES2 при примати и големи маймуни. Експресионният профил и ортологията в гените RARRES2 са неизвестни аспекти в биологията на това мултигенно семейство при примати. По този начин; ние се опитваме да опишем експресионния профил и филогенетичната връзка като допълнителни знания във функцията на този ген при приматите. За целта направихме RT-PCR от различни тъкани, получени по време на некропсии. Също така тествахме хипотезите за положителна еволюция, пречистваща селекция и неутралност. И накрая беше направен филогенетичен анализ между приматите RARRES2 протеин.

Резултати

РЕДКИ2 транскрипти присъстват в черния дроб, белия дроб, мастната тъкан, яйчниците, панкреаса, сърцето, хипоталамуса и хипофизната тъкан. Експресията в бъбреците и левкоцитите не се открива и при двата вида. Установено е, че изследваните гени са ортологични.

Заключения

РЯДКО2 еволюция се вписва в хипотезата за пречистване на селекцията. Експресионните профили на гена RARRES2 са сходни при павианите и шимпанзетата и също са филогенетично свързани.

Заден план

Чемеринът е протеин, който инициира хемотаксис чрез свързан с протеин ChemR23 - G седем-транс-мембранен домен рецепторен лиганд, който е класифициран като адипокин поради ролята му в диференциацията на адипоцитите и усвояването на глюкозата [1]. Той също така играе потенциална роля за контролиране на имунните реакции в местата на увреждане и възпаление на тъканите [2], включително хронично възпаление на мастната тъкан при затлъстяване [1, 3-5]. Чемеринът също се предлага като основен ендокринен сигнал, свързващ затлъстяването с инсулинова резистентност [3, 6–8], поради което той е независим биомаркер на метаболитния синдром [9–12]. В допълнение към мастната тъкан, хемеринът играе важна роля в метаболитната регулация в черния дроб и скелетните мускули [6, 13]. Наскоро беше идентифицирана нова роля на хемерин като стимулатор на ангиогенезата [9].

Генът на белтъка 2 (RARRES2), отговарящ на рецептора на ретиноева киселина (наричан също RAR-реагиращ протеин TIG2, чемерин и индуциран от тазаротен протеин на ген 2), който кодира хемерин, се намира в хромозома 7 при 7q36.1 при хората. РЕДКИ2 иРНК се експресира силно в бяла мастна тъкан, черен дроб и бели дробове, докато иРНК за рецептор на хемерин се експресира предимно в имунни клетки и мастна тъкан [14–20].

Изследването на еволюцията на приматите от Стария свят (OWM) и големите маймуни е отличен подход за разбиране на човешката патология като метаболитен синдром. В момента бабуинът (Papio spp) е доказано, че е идеален модел за изследване на нарушения на метаболизма. Предишни проучвания са установили значителни разлики в теглото и състава на тялото при възрастни бабуини, които споделят същата диета и условия на живот. Бабуните спонтанно развиват затлъстяване [21], захарен диабет тип 2 (T2DM) [22] и подобен на метаболитен синдром фенотип е описан при този вид [23]. Въпреки че RARRES2 генната последователност е описана при хора, няма налична информация относно павиана и шимпанзето. Настоящото проучване анализира експресионния профил и филогенетичната връзка на гена RARRES2 от бабун и шимпанзе.

Резултати

Профил на израза

В PCR от геномна ДНК се визуализира единична лента от 3257 bp и за двата примата (данните не са показани). По подобен начин в PCR от cDNA се наблюдава само един продукт от 641 bp и за двата примата. Размерите на PCR продукта и нуклеотидната последователност не са достатъчни, за да се определи липсата на паралогични гени, но с доказателствата, дадени в момента, може да бъде, че има само един RARRES2 ген за всеки от двата изследвани вида, павиан и шимпанзе. И двата гена са организирани в шест екзона и пет интрона с променлив размер: екзон 1,110 pb; интрон А, 948 pb; екзон 2, 194 pb; интрон В, 231 pb; екзон 3, 105 pb; интрон С, 1018 pb; екзон 4, 96 pb; интрон D, 244 pb; екзон 5, 127 pb; интрон Е, 175 pb; и екзон 6, 121 pb.

За всеки вид транскриптите на RARRES2 се усилват от черния дроб, белия дроб, мастната тъкан, яйчниците, панкреаса, сърцето, хипоталамуса и хипофизната жлеза. Експресия в бъбреци и левкоцити не е открита. Отрицателните и положителните контроли дадоха очакваните резултати (Фиг. 1). Всички PCR продукти бяха клонирани и секвенирани. За всеки примат бяха секвенирани поне три независими клонинги за всеки ген и транскрипт. Последователностите на иРНК на бабуни и шимпанзе са идентични за всички тъкани.

молекулярна

Скрининг на експресия на RT-PCR профил на гена RARRES2. Най-горният панел показва RT-PCR анализи от тъканите на павиана. Панелът с бутони показва RT-PCR анализи от тъканите на шимпанзето. И в двата панела лентите от 1 до 10 представляват: черен дроб, бял дроб, мастна тъкан, яйчник, панкреас, сърце, хипоталамус, хипофизна жлеза, бъбреци и левкоцити. Линии (-) показват отрицателните RT-PCR контроли. Положителните контроли (324 bp) бяха усилени с проби (641 bp)

Филогенетичен анализ

Филогенетичното дърво (фиг. 2) показва четири клади по специфичен начин. Тези класове съответстват на маймуни, OWM, NWM и лемур (извън група). Той потвърждава ортологията между гените на RARRES2 на приматите. Стойностите на Bootstrap са показани на клоните на дървото. Подобни резултати бяха получени при използване на филогенетични методи с максимална вероятност (ML), присъединяване на съседи (NJ) и UPGMA. Потвърдихме, че еволюцията на RARRES2 отговаря на хипотезата за пречистване на селекцията (P 0,05), към този момент не е ясно кои сили управляват тяхната еволюция. Неутралност се наблюдава за гените RARRES2 на орангутан, маймуна резус и раци, които ядат раци (Таблица 1).

Филогенетично дърво на RARRES2 протеини от различни примати. Дървото е построено с помощта на MEGA версия 6.06 от методите ML, NJ и UPGMA и допълнителен анализ на стартиране на 1000 реплики. Числата в клоните показват стойността на Bootstrap (получер) и под дължината на клоните, и двете се изчисляват по три метода (ML/NJ/UPGMA). Остриетата са по специфичен начин, маймуни, OWM, NWM и лемур (извън групата)

Дискусии

експресии на тРНК тъкан

Това е първият доклад, показващ експресионния профил на новата RARRES2 иРНК в различни тъкани от павиан и шимпанзе. Новото откритие на това проучване е, че при павиана и шимпанзетата има експресия в хипофизната жлеза, докато при хората RARRES2 не е открит в тази тъкан. При хората се съобщава за експресия в бъбреците (ETS профил в NCBI, UniGene), докато при павиан и шимпанзе в нашето проучване не е открита. За справяне с тази разлика проучвания като; подравняване на промоторите, биоинформатични анализи за предсказване на места за свързване на транскрипционни фактори, търсене на CpG острови, податливи на метилиране, както други; са нужни.

Сходство в модела на експресия предполага, че механизмите за регулиране на генната експресия са сходни при трите вида. Той също така предполага, че генът RARRES2 може да има подобни физиологични ефекти. Необходими са обаче повече проучвания за функционални разлики, като например изследване на профила на експресия при различни условия като инсулинова резистентност, затлъстяване, гладуване или други, свързани с метаболитен синдром.

Генна структура

Установихме, че последователността на RARRES2 кДНК при павиана и шимпанзето има голямо сходство с други маймуни. Запазването на границите екзон-интрон и липсата на очевидни мутации предполагат, че гените на павиана и шимпанзето RARRES2 са функционални.

Филогенетичен анализ

Положителният подбор (dN> dS) предполага, че заместванията, които са предимно несинонимични, са функционални и са в полза на организма, като дават известно еволюционно предимство. Докато пречиства селекцията (dN

Заключения

Установихме, че има само един ген RARRES2 за павиана и шимпанзето. RARRES2 транскрипти присъстват в черния дроб, белия дроб, мастната тъкан, яйчниците, панкреаса, сърцето, хипоталамуса и хипофизната тъкан и от двата примата. Степента на dN и dS категорично показват, че тези гени нямат положителен подбор. РЯДКО2 еволюция се вписва в хипотезата за пречистване на селекцията. Изследваните последователности са ясно ортологични.

Методи

Жилища за животни

Бабуините (Papio anubis) и шимпанзета (Пан троглодити) са били настанени в Националния изследователски център за примати в Югозапад в Сан Антонио, Тексас; акредитирано от AAALAC съоръжение в Тексаския институт за биомедицински изследвания. Тези животни са настанени с достъп на закрито и на открито в стандартни клетки от неръждаема стомана с покрити приюти, оборудвани с външни контейнери за храна и ad libitum достъп до вода. Протоколът е одобрен от IACUC на Тексаския институт за биомедицински изследвания за всички процедури.

Събиране и обработка на тъкани

Черният дроб, белите дробове, мастната тъкан, яйчниците, панкреаса, сърцето, хипоталамуса, хипофизната жлеза, бъбреците и общите левкоцити се събират при рутинна аутопсия и се съхраняват при -80 ° C до по-нататъшна оценка. Бабуиновите тъкани произхождат от три различни животни, докато тъканите на шимпанзетата идват от една жена, която е претърпяла хуманна евтаназия поради усложнение на диабета. Общата РНК и ДНК на различните тъкани и левкоцити се екстрахират с Trizol реагент съгласно инструкциите на производителя (Invitrogen, Carlsbad, CA). РНК се третира с RQ1 DNase (Promega, Madison, WI) в продължение на 15 минути при 37 ° С за отстраняване на следи от геномна ДНК. Чистотата и целостта на РНК и ДНК бяха оценени с помощта на стандартни спектрофотометрични методи с оборудване NanoDrop (Thermo Scientific, Wilmington, DE) и електрофореза в агарозен гел.

Обратна транскрипция (RT), полимеразна верижна реакция (PCR), молекулярно клониране и нуклеотидно секвениране

Обща РНК от замразени тъкани (

Филогенетичен анализ

Информацията, получена от анализите на секвениране, беше подложена на BLAST тест за определяне на идентичността. Структурите на границите на интрон-екзон на всеки един от геновете RARRES2 на павиана и шимпанзето бяха определени чрез директно извличане на информация, дадена на сървъра на NCBI. Изравняванията бяха извършени с помощта на програмата CLUSTAL W [25]. Номерата за присъединяване към GenBank на последователностите, използвани в това проучване, са дадени в Таблица 2. От аминокиселинна последователност е построено филогенетично дърво със софтуер MEGA 6.06 [26], използвайки методите за максимална вероятност (ML), присъединяване на съседи (NJ) и UPGMA, тестът thena bootstrap е направен с 1000 повторения [27].

С цел да идентифицираме еволюционните сили, които са в основата на процеса на дивергенция в гените на приматите RARRES2, тествахме хипотезата за положителна или адаптивна еволюция (dN> dS), пречистваща селекция (dN