Отдел за филиали по хранене и хигиена на храните, Училище за обществено здраве, Медицински колеж Tongji, Университет за наука и технологии Huazhong, Ухан, Китайска народна република, Министерство на образованието Ключова лаборатория за околна среда и здраве, Училище за обществено здраве, Медицински колеж Tongji, Университет за наука и технологии Huazhong, Ухан, Китайска народна република

намалени

Отдел за обществено здравеопазване, Медицински колеж WenZhou, WenZhou, Китайска народна република

Отдел за филиали по хранене и хигиена на храните, Училище за обществено здраве, Медицински колеж Tongji, Университет за наука и технологии Huazhong, Ухан, Китайска народна република, Министерство на образованието Ключова лаборатория за околна среда и здраве, Училище за обществено здраве, Медицински колеж Tongji, Университет за наука и технологии Huazhong, Ухан, Китайска народна република

Отдел за филиали по хранене и хигиена на храните, Училище за обществено здраве, Медицински колеж Tongji, Университет за наука и технологии Huazhong, Ухан, Китайска народна република, Министерство на образованието Ключова лаборатория за околна среда и здраве, Училище за обществено здраве, Медицински колеж Tongji, Университет за наука и технологии Huazhong, Ухан, Китайска народна република

Департамент по хранене и хигиена на храните, Училище за обществено здраве, Медицински колеж Tongji, Университет за наука и технологии Huazhong, Ухан, Китайска народна република, Министерство на образованието Ключова лаборатория по околна среда и здраве, Училище за обществено здраве, Медицински колеж Tongji, Университет за наука и технологии Huazhong, Ухан, Китайска народна република

Отдел за филиали по хранене и хигиена на храните, Училище за обществено здраве, Медицински колеж Tongji, Университет за наука и технологии Huazhong, Ухан, Китайска народна република, Министерство на образованието Ключова лаборатория за околна среда и здраве, Училище за обществено здраве, Медицински колеж Tongji, Университет за наука и технологии Huazhong, Ухан, Китайска народна република

Департамент по хранене и хигиена на храните, Училище за обществено здраве, Медицински колеж Tongji, Университет за наука и технологии Huazhong, Ухан, Китайска народна република, Министерство на образованието Ключова лаборатория по околна среда и здраве, Училище за обществено здраве, Медицински колеж Tongji, Университет за наука и технологии Huazhong, Ухан, Китайска народна република

Отдел за филиали по хранене и хигиена на храните, Училище за обществено здраве, Медицински колеж Tongji, Университет за наука и технологии Huazhong, Ухан, Китайска народна република, Министерство на образованието Ключова лаборатория за околна среда и здраве, Училище за обществено здраве, Медицински колеж Tongji, Университет за наука и технологии Huazhong, Ухан, Китайска народна република

Отдел за обществено здравеопазване, Медицински колеж WenZhou, WenZhou, Китайска народна република

Асоциация Министерство на образованието Ключова лаборатория по околна среда и здраве, Училище за обществено здраве, Медицински колеж Tongji, Университет за наука и технологии Huazhong, Ухан, Китайска народна република

Настоящ адрес: Департамент по хранене и хигиена на храните, Училище за обществено здраве, Университет за наука и технологии Huazhong, Ухан, Китайска народна република

Отдел за филиали по хранене и хигиена на храните, Училище за обществено здраве, Медицински колеж Tongji, Университет за наука и технологии Huazhong, Ухан, Китайска народна република, Министерство на образованието Ключова лаборатория за околна среда и здраве, Училище за обществено здраве, Медицински колеж Tongji, Университет за наука и технологии Huazhong, Ухан, Китайска народна република

  • Чонг Тиан,
  • Сяолей Й.,
  • Руй Джанг,
  • Джиа Лонг,
  • Weiye Ren,
  • Шибин Динг,
  • Дан Ляо,
  • Син Джин,
  • Хонгмей Ву,
  • Шунцин Сю

Корекция

20 септември 2013 г .: Tian C, Ye X, Zhang R, Long J, Ren W, et al. (2013) Корекция: Полифенолите на зеления чай намаляват отлаганията на мазнини при плъхове с високо съдържание на мазнини чрез път erk1/2-PPARγ-адипонектин. PLOS ONE 8 (9): 10.1371/анотация/83355f31-f12d-4b8e-9310-b60d11e37482. https://doi.org/10.1371/annotation/83355f31-f12d-4b8e-9310-b60d11e37482 Преглед на корекцията

Фигури

Резюме

Обективен

Хипоадипонектинемията допринася за развитието на затлъстяване и свързани с тях разстройства като диабет, хиперлипидемия и сърдечно-съдови заболявания. В това проучване изследвахме ефектите на полифенолите на зеления чай (GTPs) върху нивата на адипонектин и мастните натрупвания при плъхове, хранени с високо съдържание на мазнини (HF), беше изследван и механизмът на сигналния път.

Методи и резултати

Мъжките плъхове Wistar са били хранени с високомаслена диета. GTP (0.8, 1.6, 3.2 g/L) се прилагат чрез питейна вода. Адипонектинът на серума и инсулинът се измерват чрез ELISA, нивата на иРНК на адипонектин и PPARγ във висцералната мастна тъкан (VAT) се определят чрез PCR в реално време, нива на протеин на PPARγ, фосфо (p) - PPARγ, киназа с регулиран извънклетъчен сигнал (erk) 1/2 и p-erk1/2 в ДДС се определят от Western blot. Лечението с GTPs отслабва натрупването на ДДС, хипоадипонектинемията и намаленото ниво на иРНК на адипонектин в ДДС, индуцирано от HF. Намалена експресия и повишено фосфорилиране на PPARy (основният регулатор на адипонектин) и повишено активиране на erk1/2 са наблюдавани в HF групата и тези ефекти могат да бъдат облекчени чрез лечение с GTPs. За да се изследва основният механизъм, ДДС се култивира в DMEM с висока глюкоза, за да се имитира състоянието на хипергликемия in vitro. Подобно на резултатите от in vivo проучване, се наблюдават намалени нива на адипонектин, намалена експресия и повишено фосфорилиране на PPARy и повишено фосфорилиране erk1/2 в култивиран ДДС. Тези ефекти могат да бъдат подобрени чрез съвместно лечение с GTP или PD98059 (селективен инхибитор на erk1/2).

Заключение

GTPs намаляват отлагането на мазнини, подобряват хипоадипонектинемията при HF-хранени плъхове и облекчават високото индуцирано от глюкоза намаляване на адипонектина при ДДС in vitro. Анализът на сигналния път показва, че е включена регулация на PPARy, медиирана чрез erk1/2 път.

Цитат: Tian C, Ye X, Zhang R, Long J, Ren W, Ding S, et al. (2013) Полифенолите на зеления чай намаляват мастните отлагания при плъхове с високо съдържание на мазнини чрез erk1/2-PPARγ-Adiponectin Pathway. PLoS ONE 8 (1): e53796. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0053796

Редактор: Ангел Надал, Университет Мигел Ернандес де Елче, Испания

Получено: 5 октомври 2012 г .; Прието: 3 декември 2012 г .; Публикувано: 15 януари 2013 г.

Финансиране: Тази работа беше подкрепена от Националната програма за основни изследвания на Китай (Програма 973) (Проект №.2012CB722401; http://www.973.gov.cn/Default_3.aspx), Национална фондация за естествени науки на Китай (грант № 30972473, 81030051,81172674, 81273060; http://www.nsfc.gov.cn/Portal0/default152.htm). Финансистите не са играли роля в дизайна на проучването, събирането и анализа на данни, решението за публикуване или подготовката на ръкописа.

Конкуриращи се интереси: Авторите са декларирали, че не съществуват конкуриращи се интереси.

Въведение

Адипонектинът (наричан още GBP-28, apM1, AdipoQ и Acrp30) е адипоцитокин, секретиран изключително от мастната тъкан в кръвния поток. Адипонектинът отчита приблизително 0,01% от общите плазмени протеини. Хипоадипонектинемия, която се отнася до ниско циркулиращо ниво на адипонектин, е документирана при затлъстяване и свързаните с него заболявания, включително инсулинова резистентност, хипергликемия и сърдечно-съдови заболявания [12] - [14]. Натрупващите се данни показват, че хипоадипонектинемията играе ключова роля в патогенезата на затлъстяването и свързаните с него заболявания [15] - [17]. Освен това, приложението на адипонектин при затлъстели или диабетни мишки може да намали телесното тегло и нивата на кръвната глюкоза, като същевременно повиши чувствителността към инсулин [18] - [20]. Въз основа на тези данни, адипонектинът е замислен като нова терапевтична цел за затлъстяване и инсулинова резистентност [21]. Повишаването на нивото на адипонектин чрез EGCG е документирано при не-затлъстели спонтанни диабетни плъхове и плъхове със спонтанна хипертония [22], [23]. Въз основа на горното изследване предположихме, че GTPs могат да регулират нивата на адипонектин при плъхове, хранени с HF, чрез които GTPs оказват своите превантивни ефекти върху затлъстяването и свързаните с него заболявания.

В това проучване мъжките плъхове Wistar са хранени с високочестотна диета и са наблюдавани ефектите на GTP върху наддаването на телесно тегло и нивата на адипонектин. Механизмът на сигналния път беше изследван заедно с регулаторните роли на PPARγ и erk1/2.

Материали и методи

1. Декларация за етика

Това проучване е проведено в строго съответствие с указанията и разрешението за използване на лабораторни животни. Протоколът е одобрен от Комитета по етика на експериментите с животни към Университета за наука и технологии в Хуажонг (номер на разрешение: S249). Всички усилия бяха положени да сведат до минимум страданието.

2. Реактиви и материали

Анти-β актинът е от Santa Cruz Biotechnology, Inc. (Santa Cruz, CA, USA). Anti-erk1/2 и p-erk1/2 антитела са закупени от Cell Signaling Technology (Billerica, MA, USA). Анти-PPARy антитяло е закупено от Abcam (Cambridge, MA, USA); GTP (чистота> 98%) са закупени от Fuzhou Rimian Inc. (Fuzhou, Fujian, Китай); TRIZOL е от Invitrogen Inc. (Карлсбад, Калифорния, САЩ), а количественият PCR комплект в реално време е закупен от TAKARA Bio Inc. (Otsu, Shiga, Япония); ELISA комплекти за адипонектин и инсулин са закупени от R&D Systems. (MN, САЩ). Всички други химикали са от най-висок клас, налични в търговската мрежа.

3. Животни

След една седмица аклиматизация, тридесет мъжки плъхове Wistar, с тегло 40–60 g, бяха разделени на случаен принцип в 5 групи. Контролната група се хранеше със стандартна чау; останалите 4 групи са били хранени с модифицирана HF чау, съдържаща 60% (w/w) стандартна чау, 12% свинска мас, 12% захар, 6% фъстъци на прах, 8% жълтък на прах и 1% мляко на прах. От 4-та седмица 3 от 4-те групи HF започнаха да пият вода, съдържаща различни концентрации на GTPs (0,8, 1,6, 3,2 g/L). В края на 26-та седмица всички животни бяха умъртвени, тъканите бяха бързо замразени с течен азот, след което се съхраняваха при -80 ° C фризер. Тествани са биохимични индекси в кръвта, нива на адипонектин и нива на инсулин. Това проучване е проведено в строго съответствие с указанията и разрешението за използване на лабораторни животни. Протоколът е одобрен от Комитета по етика на експериментите с животни към Университета за наука и технологии Huazhong. Всички усилия бяха положени да сведат до минимум страданието.

4. ДДС култура

Мъжките плъхове Wistar бяха жертвани и ДДС бяха събрани при асептични условия. Сто петдесет mg ДДС се поддържа при 37 ° C в 5% CO2. ДДС, култивирани в DMEM с висока глюкоза, се третират без GTP, с GTP (4 µg/ml) в продължение на 48 часа или съответно с PD98059 за 1 час. Като контрол се използват ДДС, инкубирани с 5,5 mmol/L глюкоза в среда.

5. Количествена PCR в реално време

Следвайки инструкциите на производителя, общата РНК се извлича от мастна тъкан с помощта на TRIZOL, след което се определя количествено чрез UV спектрофотометрия. Използвани са проби със съотношение A260/280 между 1.8∼2.0. Реакцията на обратна транскрипция (RT) се извършва с 1 ug обща РНК от всяка проба, използвайки произволни праймери. PCR анализът в реално време се извършва с помощта на qPCR SYBR Green mix със следните параметри: 1 цикъл, 95 ° C, 5 s; 40 цикъла, 95 ° C 10 s; 57 ° C, 30 s. Промените в генната експресия се определят чрез сравнителния Ct метод с GADPH като референтен. Праймерите, използвани в PCR, са както следва: GADPH: глицералдехид-3-фосфат дехидрогеназа (GAPDH) (BC059110) в смисъл: CAG TGC CAG CCT CGT CTC AT, антисенс: AGG GGC CAT CCA CAG TCT TC; Адипонектин (NM144744) смисъл: GGT GAC CAG GAG ATG CT, антисенс: TAC GCT GAA TGC TGA GTG ATA; PPARγ (NM001145366) смисъл: TCA GGT TTG GGC GAA TG, антисенс: TTT GGT CAG CGG GAA GG .

6. Имуносорбентен анализ, свързан с ензими

За да се оцени секрецията на адипонектин и циркулиращия инсулин, кръвта на плъховете се събира и серумът се отделя чрез центрофугиране, и културалната супернатанта на мастните експланти се събира и центрофугира за отстраняване на примесите. Концентрациите на адипонектин и инсулин се измерват с помощта на ензимно-свързан имуносорбентен анализ съгласно инструкциите на производителя. Измерванията бяха извършени в шест повторения. Резултатите бяха представени като ng/mL.

7. Електрофореза и имуноблотинг

Мастната тъкан се хомогенизира и след това се лизира в екстракционния буфер, съдържащ 50 mmol/L Tris/HCl (pH 8.0), 150 mmol/L NaCl, 1% Nonidet-P40, 1% натриев дезоксихолат, 0.1% натриев додецил сулфат (SDS), 0,1 mmol/L DTT, 0,05 mmol/L PMSF, 0,002 mg/ml апротинин, 0,002 mg/ml левпептин и 1 mmol/L NaVO3 [36]. Концентрацията на протеина се определя количествено с реагент за анализ на протеин BIO-RAD DC (Bio-Rad, Hercules, CA, USA). Електрофорезата на натриев додецил сулфат-полиакриламиден гел и имунологичното попиване се извършва по метода на Amersham Biosciences. Експресията на протеин се визуализира с хемилуминесцентна система за откриване (Syngen, Cambridge, UK) и се анализира от софтуера Gel Pro 3.0 (Biometra, Goettingen, Германия).

8. Статистически анализ

Всички количествени данни са представени като Средно ± S.E. Данните бяха сравнени чрез ANOVA-SNK или T3 тест на Dunnett. Разликите се считат за значими, когато P-та седмица (C). В края на експеримента телесното тегло и коефициентът на ДДС бяха очевидно по-високи в групата с СН; ефектите бяха подобрени чрез лечение с GTP (D, E). Лечението с GTPs също намалява кръвната глюкоза и HOMA-IR индекса и обръща промяната в липидния профил при плъхове, хранени с HF (Таблица 1). Въпреки това, лечението с GTPs не повлиява нивото на циркулиращия инсулин в сравнение с HF групата.

Лечението с GTPs не повлиява енергийния прием в сравнение с групата с HF, въпреки че приемът на храна от контролната група е по-висок от другите групи (A), не се наблюдава значителна разлика в енергийния прием (B). Разликата в телесното тегло започва от 9-та седмица (С). Очевидно телесното тегло е било по-високо в групата с СН в сравнение с всички останали групи (D); Коефициентът на ДДС на HF групата очевидно е по-висок от контролната група и лечението с GTPs облекчава ефекта (E). (* P Таблица 1. GTPs понижиха нивото на кръвната глюкоза и подобриха липидния профил при плъхове, хранени с HF.

2. GTPs облекчиха понижаващата експресия на адипонектин в ДДС и серум, индуцирани от HF диета

За да се оцени експресията и секрецията на адипонектин, иРНК на адипонектин в VAT беше тествана чрез qRT-PCR, а серумният адипонектин беше тестван чрез ELISA. Фиг. 2 демонстрира, че плъхове, хранени с HF, показват по-ниски експресии на адипонектин на транскрипционни и фенотипични нива, докато лечението на GTPs облекчава редуциращия адипонектин ефект на HF диета.

Фигура 2 А показва нивото на иРНК на адипонектин в мастната тъкан, резултатът е представен в произволни единици, като се използва GADPH като референция. Фигура 2 В представя нивата на серумен адипонектин. HF групата показва значително намалена тРНК и циркулиращи нива на адипонектин, намалените експресии са отслабени чрез лечение с GTPs при различни концентрации (GL 0,8 g/L, GM 1,6 g/L, GH 3,2 g/L.) (* P Фигура 3. GTPs атенюираха фосфорилирането, намалената експресия на PPARγ и erk1/2 активирането в мастната тъкан, индуцирано от HF диета.

Нивото на PPARy mRNA беше изчислено с GADPH като референт. Експресията на протеини и фосфорилирането на PPARy и erk1/2 бяха тествани чрез Western blot; резултатите са представени в произволни единици, като се използват съответно бета-актин, PPARγ и erk1/2. Стойността на контролната група се счита за 1,00. HF регулира надолу mRNA (A, N = 6) и експресията на протеин (B, N = 3) на PPARγ, докато регулира нагоре фосфорилирането на PPARγ (C, N = 3) и erk1/2 (D, N = 3 ), ефектите могат да бъдат подобрени чрез лечение с GTPs. (* P Фигура 4. GTPs и селективен инхибитор на erk1/2 облекчават високото индуцирано от глюкоза намаляване на адипонектина.

Сто петдесет mg ДДС бяха култивирани в DMEM с висока глюкоза (33 mmol/L) и обработени с GTPs (4 ug/ml) в продължение на 48 часа или предварително обработени с PD98059 за 1 час. Супернатантът на средата за клетъчна култура се събира за ELISA на секретиран адипонектин. (А) Прието е нивото на иРНК на адипонектин, сравнителен метод на Ct с GADPH като референтен. (B) Секретираният адипонектин в супернатантата на хранителната среда е в ng/mL. Високата глюкозна инкубация (Н) регулира надолу експресията на иРНК и секрецията на адипонектин, ефектите могат да бъдат отслабени чрез лечение с GTPs (GH) или PD98059 (PD). (* P Фигура 5. Инхибирането на лечението с erk1/2 и GTPs отслабва фосфорилирането и понижаването на експресията на PPARy и активирането на erk1/2 в култивиран ДДС при високо ниво на глюкоза.