Лаборатория за клетъчна сигнализация, Университет в Кампинас, Кампинас, Бразилия, Факултет по приложни науки, Университет в Кампинас, Кампинас, Бразилия

киселини

Отделение за вътрешни болести, Университет в Кампинас, Кампинас, Бразилия

Свързана лаборатория за клетъчна сигнализация, Университет в Кампинас, Кампинас, Бразилия

Отделение за вътрешни болести, Университет в Кампинас, Кампинас, Бразилия

Свързана лаборатория за клетъчна сигнализация, Университет в Кампинас, Кампинас, Бразилия

Свързана лаборатория за клетъчна сигнализация, Университет в Кампинас, Кампинас, Бразилия

Присъединителен факултет по хранително инженерство, Университет в Кампинас, Кампинас, Бразилия

Присъединителен факултет по хранително инженерство, Университет в Кампинас, Кампинас, Бразилия

Отделение за вътрешни болести, Университет в Кампинас, Кампинас, Бразилия

Отделение за вътрешни болести, Университет в Кампинас, Кампинас, Бразилия

Лаборатория за клетъчна сигнализация, Университет в Кампинас, Кампинас, Бразилия, Катедра по вътрешни болести, Университет в Кампинас, Кампинас, Бразилия

  • Денис Е. Синтра,
  • Едуардо Р. Ропел,
  • Джулиана С. Мораес,
  • Хосе Р. Паули,
  • Хосеане Морари,
  • Клаудио Т. де Соуза,
  • Ренато Грималди,
  • Марсела Щал,
  • Хосе Б. Карвалхайра,
  • Марио Дж. Саад

Фигури

Резюме

Заден план

В експериментални модели възпалението на хипоталамуса е ранен и определящ фактор при инсталирането и прогресирането на затлъстяването. Фармакологичните и генно-базирани подходи се оказаха ефективни при ограничаване на възпалението и коригиране на фенотипите със затлъстяване. Ролята на хранителните вещества обаче в модулацията на възпалението на хипоталамуса е неизвестна.

Методология/Основни констатации

Тук показваме, че при миши модел на затлъстяване, предизвикано от диета, частичното заместване на компонента на мастните киселини в диетата с масло от ленено семе (богато на C18: 3) или зехтин (богато на C18: 1) коригира възпалението на хипоталамуса, хипоталамусна и инсулинова резистентност на цялото тяло и телесно затлъстяване. В допълнение, при инжектиране на icv при плъхове със затлъстяване, чистите мастни киселини ω3 и ω9 намаляват спонтанния прием на храна и увеличаването на телесната маса. Тези ефекти са придружени от обръщане на функционалната и молекулярна хипоталамусна резистентност към лептин/инсулин и повишена експресия на POMC и CART. В допълнение, и двете, ω3 и ω9 мастните киселини инхибират AMPK/ACC пътя и увеличават експресията на CPT1 и SCD1 в хипоталамуса. И накрая, острата хипоталамусна инжекция на ω3 и ω9 мастни киселини активира предаването на сигнала чрез наскоро идентифицирания рецептор на ненаситени мастни киселини GPR120.

Заключения/Значение

Ненаситените мастни киселини могат да действат или като хранителни вещества, или директно в хипоталамуса, връщайки индуцираното от диетата възпаление и намалявайки телесното затлъстяване. Тези данни показват, че освен фармакологични и генетични подходи, хранителните вещества също могат да бъдат привлекателни кандидати за контрол на възпалението на хипоталамуса при затлъстяване.

Цитат: Cintra DE, Ropelle ER, Moraes JC, Pauli JR, Morari J, de Souza CT, et al. (2012) Ненаситените мастни киселини връщат индуцираното от диетата хипоталамусно възпаление при затлъстяване. PLoS ONE 7 (1): e30571. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0030571

Редактор: Алисия Й. Ковалтовски, Институт де Кимика - Университет на Сао Пауло, Бразилия

Получено: 8 април 2011 г .; Прието: 20 декември 2011 г .; Публикувано: 18 януари 2012 г.

Финансиране: Тази работа е финансирана от безвъзмездни средства от Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de Sao Paulo и Conselho Nacional de Desenvolvimento Cientisto e Tecnologico. Финансистите не са играли роля в дизайна на проучването, събирането и анализа на данни, решението за публикуване или подготовката на ръкописа.

Конкуриращи се интереси: Авторите са декларирали, че не съществуват конкуриращи се интереси.

Въведение

Дефектната хипоталамусна активност играе важна роля за развитието на затлъстяване [1], [2], [3]. Редица неотдавнашни проучвания показват, че както при индуцирани от диетата, така и при генетично детерминирани животински модели на затлъстяване, възпалението на хипоталамуса е важен механизъм, водещ до аномален контрол на приема на калории и разхода на енергия [4], [5], [ 6], [7], [8], [9]. Наситените мастни киселини, силно консумирани в западните диети, индуцират възпаление на хипоталамуса чрез активиране на сигнална трансдукция чрез TLR4, което води до ендоплазмен стрес ретикулум, in situ експресия на възпалителни цитокини и в крайна сметка, апоптоза на невроните, всички допринасящи за развитието на резистентност към адипостатичен хормон аномален израз на невротрансмитерите, участващи в регулирането на енергийната хомеостаза [5], [6].

Както генетичният, така и фармакологичният подход, насочени към ограничаване на възпалението на хипоталамуса, се оказаха полезни за намаляване на хипоталамусната дисфункция, коригиране на резистентността към лептин и инсулин и намаляване на телесната маса. В този контекст, няколко протеини, участващи в възпалителния отговор в хипотамуса, са насочени към общо положителни резултати. Някои примери включват SOCS3 и IKK [8], [10], които са били насочени от генно-базирани подходи, и TNF-α, JNK и TLR4, които са били насочени по фармакологични средства [4], [5], [11 ]. Въпреки че тези резултати разкриват обещаващи подходи за лечение на затлъстяването, известната плеотропия на всички тези възпалителни пътища и необходимостта от концентриране на ефекта върху ограничен регион на мозъка налагат известна доза несигурност по отношение на бъдещото развитие на противовъзпалително средство лекарства за справяне със затлъстяването.

В други тъкани и клетъчни типове ненаситените мастни киселини имат добре известни противовъзпалителни ефекти, които варират от инхибиране на липоксигеназната и циклоксигеназната пътека и намаляване на неутрофилната адхезия [12] до намаляване на възпалителната експресия на цитокини [13] и инхибиране на TLR4 сигнализация [14]. Тъй като хранителните подходи са в основата на всички профилактични и терапевтични протоколи, използвани за справяне със затлъстяването, решихме да оценим ефектите на две ненаситени мастни киселини върху възпалението на хипоталамуса при затлъстяване. Тук показваме, че, действайки или като хранителни вещества, или директно в хипоталамуса, линоленовите (C18: 3, ω3) и олеиновите (C18: 1, ω9) ненаситени мастни киселини имат изключителни противовъзпалителни ефекти, коригирайки хипоталамусната дисфункция и намалявайки телесната маса.

Материали и методи

Експериментални животни

Плъхове и мишки са получени от развъдния център на Университета в Кампинас. Мъжки плъхове Wistar (Rattus norvegicus) с първоначална телесна маса от 180 g, получиха достъп до стандартна храна за гризачи (CT) или диета с високо съдържание на мазнини (HF,) съгласно протокол, описан по-долу и в Таблица 1. Мъжки швейцарски мишки ( Mus musculus) с първоначална телесна маса от 13 g, беше разрешен достъп до стандартна чау гриза (CT), диета с високо съдържание на мазнини (HF), HF + масло от ленено семе (FS) (поетапни замествания, съответстващи на 10, 20 или 30% от обща калорична стойност) или HF + зехтин (OL) (поетапни замествания, съответстващи на 10, 20 или 30% от общата калорична стойност), както е описано по-долу и в Таблица 1. Всички животни са получавали диета и вода ad libitum и са били поддържани в отделни клетки при 21 ± 2 ° C, с 12-часов тъмен/12-часов светлинен цикъл. Всички експерименти са проведени в съответствие с принципите и процедурите, описани от Националните здравни насоки за грижи и използване на опитни животни и са одобрени от Етичния комитет на Университета в Кампинас (ID 2010/0256).

Експериментални протоколи

Антитела, химикали и буфери

Тест за интраперитонеален инсулинов толеранс (ipITT)

След 6 часа гладуване, CT, HF, FS- и OL-заместени групи мишки бяха подложени на тест за толерантност към инсулин (1 U/kg телесно тегло -1 инсулин). Мишките се инжектират с инсулин и кръвни проби се събират на 0, 4, 8, 12 и 16 минути от опашната вена за определяне на серумна глюкоза. Константата за скоростта на изчезване на серумна глюкоза се изчислява, използвайки формулата 0.693/биологичен полуживот (t1/2). Плазмената глюкоза t1/2 е изчислена от наклона на последния квадратен анализ на плазмената концентрация на глюкоза по време на линейната фаза на спад [15].

Тест за интраперитонеален глюкозен толеранс (ipGTT)

След 6 часа на гладно, мишките бяха подложени на тест за глюкозен толеранс. След събиране на неоспорена проба (време 0), разтвор от 20% глюкоза (2,0 g/kg телесно тегло) се прилага в перитонеалната кухина. Кръвни проби се събират от опашната вена на 30, 60, 90 и 120 минути за определяне на концентрациите на глюкоза. Резултатите са представени като площ под кривите на глюкозата. Серумната глюкоза както на ipITT, така и на ipGTT се определя с помощта на глюкометър (Roche Diagnostic, Rotkreuze, Швейцария).

Поведение при хранене

Плъховете, лишени от храна в продължение на 6 часа със свободен достъп до вода, се инжектират icv (2μl) с разтвори, съдържащи албумин (75 µM) или лептин (1.0 µM). След това диетите бяха въведени отново и приемът на храна беше определен в края на 12-часов период.

Icv канюлация

Определянето на общото съдържание на липиди и LPS в диетите се извършва с помощта на HPLC метод, описан по-рано [18]. Накратко, мастните киселини се дериватизират с 4-бромометил-7-кумарин и анализът се извършва в течен хроматограф на Shimadzu модел LC-10A. Пробите се елуират, като се използва колона С8 (25 cm × 4.6 id, 5 µm частици) с C8 предколона (2.5 cm × 4.6 id, 5 µm частици), 1.0 ml/min ацетонитрил/вода (77%/23 %, v/v) детектор за дебит и флуоресценция (325 nm възбуждане и 395 nm емисия). За количествено определяне на мастните киселини бяха определени факторът на капацитета, елуиращата последователност, линейността, възстановяването, точността, интерференцията и границата на откриване. Долната граница на откриване е 1,0 pg и като пречистващ агент се използва високо пречистен LPS.

Газова хроматография

Относителните количества мастни киселини в диетите, кръвта и хипоталамите се определят чрез газова хроматография, като се използва Shimadzu Model 17A, при следните работни условия: капилярна колона от разтопен силициев диоксид (100 × 0,25 mm; SP-2560); водород като газ-носител, със скорост на потока 20 cm/s; Температурата на фурната, първоначално 140 ° C за 5 минути, се повишава до 240 ° C при 4 ° C/min и се поддържа при 240 ° C за 30 минути; инжектор, съотношението на разделяне е 1∶50, температура 250 ° C; температурите на изпаряване и детектор са съответно 250 ° C и 260 ° C. Инжекционният обем е 1 µl пробен разтвор. Времето на задържане на стандартите за метилов естер (Sigma Aldrich) бяха използвани за идентифициране на пикове. Липидите, извлечени от диети, кръв и хипоталами, се съхраняват при -20 ° C, защитени от светлина.

Имунохистохимия и хистология

Протеинов анализ чрез имунопреципитация и имуноблотинг

PCR в реално време. Обратната транскрипция беше извършена с използване на обща РНК от хипоталамусни проби, както е описано по-рано [19]. NPY, POMC, CART и MCH иРНК бяха измерени в хипоталамите на плъхове, лекувани с CD или HF диети и в интрацеребровентрикуларни канюлирани плъхове, третирани с линоленова и олеинова киселина. Интрон-пропускащи праймери за NPY, AGRP, MCH и POMC са получени от Applied Biosystems. Глицералдехид-3-фосфатдехидрогеназните праймери (Applied Biosystems) бяха използвани като контрола. PCR анализ в реално време на генната експресия се извършва в система за откриване на последователност ABI Prism 7700 (Applied Biosystems). Оптималната концентрация на cDNA и праймери, както и максималната ефективност на амплификация, бяха получени чрез анализ на кривата на двукратно разреждане с пет точки за всеки ген. Всяка PCR съдържа 3.0 ng обратно-транскрибирана РНК, 200 nM от всеки специфичен праймер, SYBR SAFE PCR master mix и RNase вода, добавена до 20 µl краен обем. Данните в реално време бяха анализирани с помощта на Sequence Detector System 1.7 (Applied Biosystems).

Статистически анализ

Специфични протеинови ленти, присъстващи в петна, бяха количествено определени чрез цифрова денситометрия (ScionCorp). Дисперсионният анализ е използван за сравняване на независими проби. Средните стойности ± SEM, получени от сканиране на денситометрия и от PCR измервания в реално време, определяне на телесна маса, прием на храна, площ под кривите на глюкозата и Kitt бяха сравнени с помощта на теста на Tukey и P Таблица 2. Състав на мастните киселини на диетите (% от общите мазнини ).

Влияние на промяната в диетата върху кръвта и хипоталамовите мастни киселини

Консумацията на високочестотна диета доведе до значително увеличение на C18: 0, C20: 0 и C22: 0 и до значително намаляване на общия ω3 в кръвта в сравнение с мишки, хранени с чау (Таблица 3). Замяната на 10% FS води до значително увеличение на общото съдържание на ω3 в кръвта и намаляване на съотношението ω6∶ω3 от 7,1 до 3,2, в сравнение с мишки, хранени с HF (Таблица 3). Замяната на 10% OL не доведе до значително увеличение на общото съдържание на ω9 в кръвта, но доведе до значително намаляване на общото кръвно съдържание на наситени мастни киселини в сравнение с мишки, хранени с HF (Таблица 3). В хипоталамуса, високочестотната диета води до значително увеличение на C20: 0 и C22: 0, в сравнение с мишки, хранени с чау (Таблица 4). Замяната на 10% FS води до намаляване на нивата C20: 0 и C22: 0 и намаляване на съотношението ω6∶ω3 от 1∶1.29 на 1∶1.65 в хипоталамуса, в сравнение с мишки, хранени с HF (Таблица 4). Замяната на 10% OL води до значително намаляване на относителното съдържание на C20: 0 и C22: 0 в хипоталамуса в сравнение с мишки, хранени с HF (Таблица 4).

Заместванията на FS и OL в диетата намаляват приема на храна и увеличаването на телесната маса

A, Среден дневен спонтанен прием на храна (g) от швейцарски мишки, хранени с редовна чау (CT), диета с високо съдържание на мазнини (HF), ленено семе (FS) или заместен зехтин (OL) (10, 20 или 30% ) диети за осем седмици; резултатите се изобразяват като ежедневен прием на храна през цялото време (A) и като средства, получени през целия период (A1). B, Промяна на телесната маса за всяка група през целия експериментален период. C-E, вариация на телесната маса (g) през 60-дневния експериментален период (C-E) или през всеки от четирите 15-дневни експериментални периода (C1-E1) за CT и HF групи (C, C1); за FS заместени групи (D, D1); и за заместените с OL групи (E, E1). F, Тест за предпочитание към диетата, постни швейцарски мишки се гладуват 10 часа и след това се предлагат подобни количества CT или HF (HF) диети; същият подход беше използван за сравняване на предпочитанията за всяка от заместените с FS или OL диети срещу СН; резултатите са представени като относителна консумация на калории на тестваната диета в продължение на 12 часа. Във всички експерименти n = 5; в A и B, #p Фигура 3. Метаболитни параметри.

Нива на глюкоза в кръвта (A) и постоянни за глюкозен разпад по време на тест за инсулинов толеранс (Kitt) (%/min) (A1); и, нивата на глюкоза в кръвта (B) и площта под кривата на глюкозата (AUC) (B1) по време на интраперитонеален тест за толерантност към глюкоза (ipGTT) са получени в края на осемседмичен експериментален период за швейцарски мишки, хранени с редовна чау (CT ), диети с високо съдържание на мазнини (HF), диети с ленено семе (FS) или зехтин (OL) (10, 20 или 30%). Във всички експерименти n = 5; #p Фигура 4. Предаване на сигнала в хипоталамуса.

Хипоталамусни екстракти от общ протеин, получени от швейцарски мишки, хранени с редовна чау (CT), диета с високо съдържание на мазнини (HF), диети с ленено семе (FS) или зехтин (OL) (10, 20 или 30%) в продължение на осем седмици са използвани в експерименти с имуноблотинг (IB) за оценка на експресията на протеин и/или активността. Специфични антитела срещу фосфо-IκB-α (P-IκBα) (A), фосфо-JNK (P-JNK) (B), TNF-α (C), SOCS-3 (D), iNOS (E), IL- 10 (F), Caspase-3 (CASP-3) (G), BAX (H), Bcl-2 (I), фосфо-ACC (P-ACC) (J), FAS (K) и CPT-1 ( L) са използвани за идентифициране на съответните протеинови цели. Зареждането беше оценено чрез повторно сондиране на мембраните с анти-β-актин (A, C-I, K и L), анти-JNK (B) или анти-ACC (J) антитела. Във всички експерименти n = 5; #p Фигура 5. Прием на храна, телесна маса и затлъстяване при лекувани с icv плъхове.

Плъховете на Wistar, хранени с редовен чау (CT) или с диета с високо съдържание на мазнини (HF), бяха icv канюлирани и третирани в продължение на пет (A) или седем (BF) дни с разредител (албумин, Alb), ω3-, ω9-мазни киселини или стеаринова киселина (SA) и след това се използват за определяне на хранително поведение и затлъстяване. A, дневен прием на храна (g) от плъхове, третирани icv с Alb (запълнени кръгове), ω3 (запълнени квадратчета) или ω9 (запълнени триъгълници) мастни киселини в продължение на пет дни; началото (I) и краят (II) на лечението са обозначени със стрелки. B, Потискането на спонтанния прием на храна (g) от лептин беше оценено в края на експерименталния период. C, Промяна на телесната маса (g) през седемдневния период на лечение на icv. D, Епидидимална мастна маса (g) в края на експерименталния период. E, Хистологична оценка (оцветяване на хематоксилин-еозин от 5 µm секции) на епидидимална мазнина. F, Средна площ на адипоцитите, получена от хистологични срезове. Във всички експерименти n = 5. В A, C и D, * p Фигура 6. Експресия на възпалителни и апоптотични протеини в хипоталамуса на лекувани с icv плъхове.

Плъховете Wistar, хранени с обикновена чау (CT) или с високомаслена диета (HF) и icv канюлирани, бяха третирани в продължение на седем дни с разредител (албумин, Alb), ω3 или ω9 мастни киселини и след това използвани при имуноблотинг (IB) и експерименти с имуфлуоресценция. Специфични антитела срещу iNOS (A), IL-6 (B), TNF-α (C), IL-10 (D), фосфо-JNK (P-JNK) (E), BAX (G) и Bcl-2 (H) бяха използвани за идентифициране на съответните протеинови цели в хипоталамусните проби. Зареждането се оценява чрез повторно сондиране на мембраните с анти-β-актин (A-D, G и H) или анти-JNK (E). В F, 5 µm участъци от хипоталамуса са белязани с анти-F4/80 антитяло. Във всички експерименти n = 5. В A-E, * p Фигура 7. Ефект на icv ω3 и ω9 върху хипоталамусната сигнализация.

Плъховете Wistar, хранени с обикновена чау (CT) или с високомаслена диета (HF) и icv канюлирани, се третират в продължение на седем дни с разредител (албумин, Alb), ω3 или ω9 мастни киселини. В допълнение, в някои експерименти плъховете са били лекувани остро с единична доза лептин (2 µl, 10-6 M: AG) или инсулин (2 µl, 10-6 M: H) и след това са използвани при имуноблотинг (IB) експерименти. Специфични антитела срещу фосфо-JAK2 (P-JAK2) (A и D), фосфо-STAT3 (P-STAT3) (B и E), фосфо-Akt (P-Akt) (C, F и H), фосфо-FoxO1 (P-FoxO1) (G), фосфо-ACC (P-ACC) (I), FAS (J), CPT-1 (K) и SCD-1 (L) бяха използвани за идентифициране на съответните протеинови цели в хипоталамусната тъкан. Зареждането беше оценено чрез повторно сондиране на мембраните с анти-β-актин (JL), анти-JAK2 (A и D), анти-STAT3 (B и E), анти-Akt (C, F и H), анти- FoxO1 (G) или анти-ACC (I). В A-H, #p Фигура 8. Ефект на icv ω3 и ω9 върху експресията на невротрансмитера и термогенезата.

Плъховете Wistar, хранени с обикновена чау (CT) или диета с високо съдържание на мазнини (HF) и icv канюлирани, бяха третирани в продължение на седем дни с разредител (албумин, Alb), ω3 или ω9 мастни киселини и след това използвани в PCR в реално време и експерименти с имуноблотиране. Общата РНК, получена от хипоталами, се използва в PCR в реално време за усилване на иРНК на NPY (A), MCH (B), POMC (C) и CART (D). Екстракти от общ протеин на кафява мастна тъкан бяха използвани за оценка на експресията на UCP-1 чрез имуноблот (Е). Във всички експерименти n = 5. В A-D, * p Фигура 9. Предаване на сигнала GPR120 в хипоталамуса.