• Намерете този автор в Google Scholar
  • Намерете този автор в PubMed
  • Потърсете този автор на този сайт
  • Запис на ORCID за Джесика Л. Макдоналд
  • За кореспонденция: [email protected]

Резюме

Въведение

Патофизиологичните нарушения в развитието на невроните и свързаността в рамките на неокортекса, мозъчната област, отговорна за високите когнитивни и асоциативни функции, се появяват при множество невроразвитие. Например намаляването на свързаността (Frazier и Hardan, 2009) и синхронизирането между двете мозъчни полукълба е често срещано при нарушения на аутистичния спектър (ASD) (Dinstein et al., 2011). Тези интерхемисферни връзки се осъществяват от аксоните на калозално-проекционните неврони (CPN), широка популация от комисурални неврони, които се определят от разширението на аксон през corpus callosum (CC), най-големият аксонен тракт в мозъка на бозайниците, за да се свържат двете мозъчни полукълба. CPN са възбуждащи пирамидални проекционни неврони, които се намират в неокортикалните слоеве (~ 80% в слоеве II/III при мишка, 20% в V и малък процент в VI), но те са преобладаващият подтип на проекционния неврон в слоевете II/III.

нетипично

CPN са хетерогенна популация от междусферични неврони; те изразяват уникални комбинации от гени, които ги определят като широка популация, както и други гени, които идентифицират различни субпопулации в CPN по време на развитието (Molyneaux et al., 2009; Fame et al., 2011; MacDonald et al., 2013). Например, CPN във всяка функционална неокортикална област имат различни молекулярни и морфологични характеристики (Lomber et al., 1994; Olivares et al., 2001; Grove and Fukuchi-Shimogori, 2003; Benavides-Piccione et al., 2006; O'Leary и др., 2007). Нарушенията в развитието и свързаността на CPN са свързани с множество невроразвитие, включително ASD (Egaas et al., 1995; Piven et al., 1997; Mukaetova-Ladinska et al., 2004; Herbert and Kenet, 2007; Frazier and Hardan, 2009; Srivastava et al., 2012), синдром на Rett (Belichenko et al., 1994; Armstrong et al., 1995; Kishi and Macklis, 2004, 2010; Wood et al., 2009; Ribeiro et al., 2020), ADHD (Hynd et al., 1991; Roessner et al., 2004; Seidman et al., 2005) и шизофрения (Swayze et al., 1990; Tibbo et al., 1998; Innocenti et al., 2003; Wolf et al. ., 2008). По този начин CPN играят ключови, разнообразни роли в сложното асоциативно и интегративно познание, а нарушенията в тяхното развитие коренно променят поведението.

Експериментални процедури

Имунохистохимия

Имунохистохимията се извършва, както е описано по-рано (Fame et al., 2016). Накратко, мозъците бяха фиксирани за една нощ в 4% PFA/PBS при 4 ° C, след което бяха разделени на вибрационен микротом VT1000S (Leica Microsystems). Секциите бяха инкубирани в първични разреждания на антитела при 4 ° С за една нощ и подходящи вторични антитела бяха избрани от серията Molecular Probes Alexa (Invitrogen, Carlsbad, CA). Необходими са методи за извличане на антигени, за да се изложат антигени за някои от първичните антитела. Секциите се инкубират в 0.1 М лимонена киселина (рН = 6.0) в продължение на 10 минути. при 95-98 ° С. Използвани са първични антитела, както следва: анти-CTIP2 от плъх (Abcam Cat # ab18465, RRID: AB_2064130), заешка анти-β-галактозидаза (Thermo Fisher Scientific Cat # A-11132, RRID: AB_221539), миши анти-SATB2 (Abcam Cat # ab51502, RRID: AB_882455), заешки анти-TBR1 (Abcam Cat # ab31940, RRID: AB_2200219), заешки анти-BHLHB5 (Abcam ab204791), миши анти-NeuN (Millipore Cat # MAB377, RRID: AB_2298772). Вторични антитела от Invitrogen Alexa Series (Invitrogen).

Количествено определяне на неокортикалната дължина и дебелина

Всички измервания на дължина и дебелина бяха извършени с изображения на съответстващи сагитални 50μm участъци, използвайки ImageJ за проследяване на кривината на неокортикалната повърхност. Соматосензорната област беше идентифицирана чрез експресията на Bhlhb5 в слоеве II/III. Дълбоките слоеве (V-VI) бяха идентифицирани като тези, включително клетки, експресиращи високи нива на CTIP2 и по-дълбоки. Повърхностните слоеве (II-IV) бяха идентифицирани като тези повърхностни до високо ниво на експресия на CTIP2.

Поведение

За всички поведенчески тестове на мишките беше позволено да се аклиматизират в помещението за тестване за период от 30 минути. Всеки тест беше проведен по едно и също време на деня за всички носилки от един и същ експериментатор, сляп за генотип. Провежда се само един анализ на ден, започвайки, когато мишките достигнат 10-седмична възраст. По-специфичните методи за всеки тест са както следва:

Ултразвукови вокализации

След аклимацията малките бяха изолирани от язовира си в предварително затоплена клетка. След това малките се поставят индивидуално в камерата за затихване на звука и техните USV се записват с ултразвуков микрофон (Patterson M500-384) за период от пет минути. След този петминутен период новородените бяха върнати в предварително затоплената си клетка. Броят на разговорите, средната продължителност на разговорите и пиковата честота на разговорите бяха измерени с помощта на софтуера Noldus UltraVox XT. Отделни USVs се броят, ако отговарят на следните критерии; честотата е между 30kHZ и 125kHz, продължителността е между 5ms и 500ms с интервал ≥6ms, а амплитудата е по-голяма от 250a.u. над фона. Важно е да се отбележи, че няма видима разлика в размера на малките въз основа на генотипа. Тъй като това е специфичен за предния мозък cKO, новородените се очаква да нямат разлика в белодробния капацитет или физическата способност да осъществяват повиквания.

Отворено поле Maze

Открит лабиринт, използващ система за запис на фото лъчи (SD Instrument), беше използван за записване на активност в нова прозрачна кутия (40 cm × 40 cm) в продължение на 30 минути с фонов бял шум от d70 dB и ниво на интензивност на светлината 1000 лукса. Разстоянието на пътуване на мишката, скоростта на пътуване, времето, прекарано в почивка и отглеждане, бяха записани и количествено определени с помощта на софтуера PAS Reporter на SanDiego.

Светло-тъмна кутия

Цитираните 2 cKO животни се представят сравними с WT в анализи, които измерват поведение, подобно на тревожност, включително класическия лабиринт Elevated-Plus и Light-Dark Box (А), По време на 5-минутния тест с повишен плюс, Cited2 cKO мишки се държаха подобно на WT, тъй като прекарваха повече време в затворено рамо, отколкото в отворено. (Б), Cited2 WT, HET и cKO мишки прекараха подобно време в светлата част на кутията Light-Dark, което показва, че няма промени в поведението, подобно на тревожност. И трите генотипа показват сравним брой преходи между светлите и тъмните части на кутията, което показва сходни общи нива на активност. (° С), Cited2 cKO мишки демонстрираха подобна комуникативност на WT в Трикамерния тест за социални предпочитания, като и трите генотипа прекарваха повече време с нова мишка, количествено изразена в стълбовата графика и визуализирана с представителната топлинна карта на мъжете WT и Cited2 cKO. М, нова мишка; О, роман обект. N = 8-14 мишки за генотип и пол. Жените и мъжете са представени съответно с червени и сини точки. Еднопосочен ANOVA с пост-тест на Tukey е използван за определяне на статистическа значимост.

Трети често срещан фенотип на много невроразвитие е дефицитът в социалните взаимодействия. При модели на мишки социалните взаимодействия често се оценяват с помощта на трикамерния тест за социални предпочитания (Yang et al., 2011). Използвахме този анализ, за ​​да изследваме потенциални разлики в социалните взаимодействия поради загуба на функция на Cited2. Интересното е, че Cited2 cKO и HET мишки се представят подобно на WT, прекарвайки повече време с новата мишка, отколкото с новия обект, което показва, че няма промяна в социалните предпочитания (Фиг. 4C).

Цитиран2 условен нокаут причинява значително прекъсване на привикването на слухово стряскане]

(А), За да оценим стряскащия отговор, инхибирането преди пулса и привикването/сенсибилизацията, използвахме триблоков анализ, използвайки лабораторния апарат в Сан Диего SR. Първият и третият блок се състоят от 120dB акустичен тон, повторен 12 пъти за измерване на стряскаща реакция и привикване/сенсибилизация, вторият се състои от шест различни вида стимули, представени в псевдо произволен ред за оценка на инхибирането преди пулса. (Б), Цитираните жени2 HET и cKO мишки не показват разлики в инхибирането преди пулса (PPI) в сравнение с WTs, докато мъжете (° С) показват тенденции към намаляване на PPI с по-ниски нива преди импулса; тенденциите обаче не са статистически значими. (Д), Не наблюдавахме обаче генотип или полова разлика за среден стряскащ отговор, (Е.) Посочените 2 cKO мишки от двата пола демонстрират намалено привикване през целия тест. Средно отговорът им на акустичен стимул в блок № 3 е по-голям от отговора им в блок № 1, което предполага, че те стават по-чувствителни към акустичното стряскане с напредването на теста. N = 8-15 на пол и генотип. Жените и мъжете са представени съответно с червени и сини точки. * p ↵