Резюме

Глюкокортикоидите са важни регулатори на ренин-ангиотензиновата система (15, 21), а прекомерното излагане на плода на глюкокортикоиди от майчин произход се смята за централно за хранителното програмиране на кръвното налягане (8, 22). Установено е, че прилагането на синтетичен глюкокортикоид дексаметазон по време на бременност предизвиква хипертония при потомството при плъхове (6, 31, 41) и овце (9). Фармакологичната адреналектомия на хранени с MLP язовири на плъхове предотвратява тяхното потомство от развитие на хипертония (21). Развиващите се фетални тъкани са защитени от високите нива на майчините глюкокортикоиди от ензима 11β-хидроксистероид дехидрогеназа (11βHSD2), който превръща естествено срещащите се глюкокортикоиди в неактивни форми (10). Показано е, че експресията на този ензим е хранително чувствителна както при плъхове (7, 27), така и при овце (36, 53), а понижаването на регулацията на 11βHSD2 може да доведе до прекомерно излагане на феталните тъкани на майчините глюкокортикоиди по време на критични периоди на развитие. Следователно това проучване изследва хипотезата, че взаимодействието между тези две хормонални системи може да осигури механизъм, чрез който майчиното недохранване програмира кръвното налягане.

Всички експерименти са проведени в съответствие с Ръководните принципи за грижа и използване на животните на Американското физиологично общество.

Животни.

Бременните плъхове остават на полусинтетични диети, докато раждат на 22-дневна бременност. След това всички животни бяха прехвърлени на стандартна лабораторна чау-диета (B&K Universal, Hull, UK) и кучилата бяха отбранени до максимум осем малки, за да се сведат до минимум вариациите в храненето на сучещите. Следователно потомството на четирите лечебни групи се различава само по пренатална хранителна и глюкокортикоидна експозиция. Излишните малки, отбрани при раждането, са използвани за осигуряване на проби от новородени тъкани. На 4 седмици на възраст, потомството е отбито от чау-диета и е убито чрез задушаване на CO2, последвано от дислокация на шийката на матката след определяне на кръвното налягане. Бъбреците бързо се изрязват и десните бъбреци се замразяват в течен N2, преди да се съхраняват при -80 ° C за по-късен анализ.

Определяне на кръвното налягане.

Систоличното кръвно налягане и пулсът се определят в три екземпляра, като се използва добре утвърден, валидиран, непряк метод на маншета на опашката, както беше съобщено по-рано (47). Данните за кръвното налягане, получени по този метод, са проверени чрез дистанционни телеметрични методи с хронично катетеризирани животни (55). Плъховете се аклиматизират до температура 27 ° C за 2 часа преди измерването и измерванията се извършват в рамките на 2–10 минути след задържане.

Експресия на иРНК на рецептор за ангиотензин.

Обща РНК се изолира от бързо замразени бъбреци, като се използва процедурата Trizol (Invitrogen, Renfrew, UK). РНК се третира с DNase (Promega, Southampton, UK) и се подлага на фенол-хлороформ екстракция и утаяване с етанол. Общата РНК (0,5 μg) се транскрибира обратно, като се използва обратна транскриптаза на вируса на миша левкемия на Moloney (Promega). PCR в реално време се извършва, като се използва система за откриване на последователност ABI Prism 7700 (Applied Biosystems, Warrington, UK). Специфична за шаблона двойка праймери и олигонуклеотидна сонда (Sigma-Genosys, Кеймбридж, Великобритания), специфични за всеки от AT1AR, AT1BR и AT2R и домакинския ген β-актин са проектирани с Primer Express, версия 1.5 (Applied Biosystems). Пълните последователности на праймерите и сондите са показани в Таблица 1. Всички набори праймери са тествани при PCR условия на TaqMan, като се използва геномна ДНК на плъх като шаблон. Във всички случаи се открива единичен продукт с подходящ размер чрез извършване на гел електрофореза (резултатите не са показани). Отрицателна контролна матрица и относителна стандартна крива бяха включени във всяко PCR изпълнение. Стандартната крива беше получена от група от кДНК на проба при относителни разреждания от 0,05, 0,1, 0,2, 0,4, 1,0, 2,5 и 5,0 и от тази крива беше изчислено относителното целево количество. Всички проби бяха нормализирани до експресия на β-актин.

маса 1. Последователности на грунд и сонда

ATIAR, ангиотензин рецептор 1А; ATIB, ангиотензинов рецептор 1В; AT2R, рецептор за ангиотензин 2.

Статистически анализ.

Резултатите са представени като средни стойности ± SE. Параметрите на майката бяха сравнени между групите, използвайки еднопосочен ANOVA. Ефектите от групата и пола върху измерванията на новородени и 4-седмично потомство бяха сравнени с помощта на двупосочна ANOVA. Котилото за произход беше включено като ковариат във всички постнатални анализи, за да се коригира резултатът за йерархичната променливост, получена от същата или различна майка. Данните за кръвното налягане са коригирани спрямо телесното тегло, както беше съобщено по-рано (35). Тестът за най-малко значима разлика е използван като post hoc тест, при който ANOVA показва значими взаимодействия. Вероятност

Таблица 2. Наддаване на тегло на майката и прием на храна по време на бременност, размер на котилото и средно тегло при раждане на потомството

Данните са средно ± SE. Контролирайте физиологичен разтвор, н = 6; MLP физиологичен разтвор, н = 6; MLP се срещна, н = 5; MLP корт, н = 5.

* Коригирано за размера на котилото. MLP, майчина диета с ниско съдържание на протеини; срещнат, метирапон; корт, кортикостерон; FI, прием на фураж. a> b; P

бременност

Фиг. 1.Ефект на вътреутробния опит с диети и глюкокортикоиди върху кръвното налягане и пулса на потомството на 4 седмици. A: систолично кръвно налягане при мъжки плъхове. Б.: систолично кръвно налягане при женски плъхове. ° С: пулс при мъжки плъхове. д: пулс при женски плъхове. Стойностите са средни стойности ± SE. н се показва във всяка лента. MLP, майчина диета с ниско съдържание на протеини; Sal, физиологичен разтвор; Met, метирапон; Корт, кортикостерон. а > б; P

На 4 седмична възраст експресията на AT1AR и AT1BR иРНК отново не се повлиява от MLP in utero. Въпреки това, ефект от експозицията на глюкокортикоиди върху AT1AR се наблюдава както при мъжете, така и при жените. При мъжете експресията на mRNA на AT1AR е значително по-висока в групата, лекувана с кортикостерон, отколкото във всяка друга група (Фиг. 2Б.; P

Фиг. 2.Ефект на вътреутробния опит с диетата и глюкокортикоидите върху експресията на ангиотензин рецептор 1А (AT1AR), AT1BR и AT2R в бъбреците на потомството при раждане (A; н = 13, 14, 15, 20) и на възраст 4 седмици при мъжете (Б.; н = 9, 10, 11, 12) и жени (° С; н = 12, 9, 10, 10). Стойностите са средни стойности ± SE. а > б; P = 0,067. ° С > д; P е; P

При бъбреците от несексирани новородени животни, експресията на AT1AR и AT1BR иРНК не е била значително повлияна от диетичен или глюкокортикоиден опит в утробата (Фиг. 2A). Имаше тенденция експресията на AT2R иРНК да следва същия модел във всичките четири групи (Фиг. 2A), както се наблюдава при 4-седмично потомство, но това не успя да достигне статистическа значимост (P = 0,067).

Данните показват, че повишеното регулиране на ренин-ангиотензиновата система, особено чрез промени в експресията на ATR, може да играе роля в програмирането на кръвното налягане на плода (35, 44, 47). Смята се, че глюкокортикоидите играят централна роля във феталното програмиране на заболяването при възрастни и са мощни регулатори на ренин-ангиотензиновата система (15, 22, 23). Следователно ние предположихме, че взаимодействието между глюкокортикоидите и експресията на ATR може да осигури механизъм, чрез който кръвното налягане се програмира вътреутробно и сме изследвали тази хипотеза, използвайки добре установен модел на хранителни програми за плъхове.

Данните за кръвното налягане възпроизвеждат нашата постоянна констатация, че храненето с MLP диета през цялата бременност при плъхове програмите относителна хипертония в полученото потомство (13, 24, 25, 29). По-рано беше показано, че фармакологичната адреналектомия на майки, хранени с MLP, предотвратява хипертония при потомството (21). Metyrapone инхибира стъпката на 11β-хидроксилаза на синтеза на стероиди, блокирайки синтеза на кортикостероиди при майката и плода. Приложение на метирапон между дните 1 и 14. на бременността, преди активирането на надбъбречната жлеза на плода, гарантира, че обратимите ефекти на кортикостерон могат да се отдадат на ефекти само върху синтеза на глюкокортикоиди при майката. Метирапонът обаче не е специфичен за глюкокортикоидите в своето действие. Широки нарушения на ендокринната функция на майката следват приложението на този агент. Включването на кортикостероновата група имаше за цел да изясни специфичните за глюкокортикоидите ефекти на лекарството.

Нашата работна хипотеза беше, че подобно регулиране може да бъде медиирано от глюкокортикоиди. Въпреки това, намаляването на експресията на иРНК на AT2R не е предотвратено чрез лечение с метирапон и AT2R всъщност е увеличен в отговор на лечението с кортикостерон при майката. Това е в съответствие с работата с бременната овца, при която е показано повишаване на експресията на AT2R в отговор на пренаталното лечение с дексаметазон (39). Това показва, че макар и чувствителен към глюкокортикоиди, намаляването на AT2R иРНК при женски плъхове, изложени на MLP диета вътреутробно, не зависи от глюкокортикоидите. Въз основа на тези данни трябва да се спекулира, че хранителни и стероидни (39, 46) модели на фетално програмиране не могат да се третират като еквивалентни. Индуцираното от кортикостерон повишаване на експресията на AT2R иРНК не е свързано с промяна в кръвното налягане. Това несъответствие подчертава необходимостта от по-нататъшно проучване, за да се изясни дали временната връзка между намалена експресия на AT2R, повишена чувствителност към ANG II и повишено кръвно налягане означава пряка, причинно-следствена, действителна връзка и се провеждат фармакологични проучвания с използване на ATR антагонисти за тестване на тази връзка.

Това проучване е първото, което изследва mRNA експресията на ATR в бъбреците на изложени на MLP потомство при раждането и въпреки че не достига статистическа значимост (P = 0,067), трябва да се отбележи, че един и същ модел на експресия на AT2R иРНК се наблюдава във всичките четири групи, както се наблюдава при женските бъбреци на възраст 4 седмици. Това показва, че експресията на AT2R иРНК е нарушена от ранен стадий на нефрогенеза и следователно не е вторична спрямо хипертоничния фенотип. Доказано е, че ANG II е критичен за нормалното бъбречно развитие и функционирането на феталния бъбрек (14, 32), а AT2R е преобладаващият ATR по време на феталния живот (50). Намаляването на регулацията на медиираните от AT2R ефекти на ANG II в този критичен момент може да обясни нарушено бъбречно развитие в този модел, както се демонстрира чрез намалено число на нефрона (30, 33) и скорост на гломерулна филтрация (26, 43). Предвиждат се по-нататъшни проучвания за изясняване на тези неонатални данни, включително ефекта от пола, и за изясняване на онтогенезата на разликите между групите.

Резултатите от това и предишното ни проучване показват, че на възраст 4 седмици мъжкото потомство е развило глюкокортикоидно-зависима хипертония без участие на променена експресия на бъбречна ATR иРНК. За разлика от тях, женските потомци показват хипертония, независима от глюкокортикоиди, свързана с подобно независимо от глюкокортикоиди намаляване на експресията на бъбречна AT2R иРНК, което показва възможна свръхчувствителност към хипертоничните ефекти на ANG II. Липсата на интерактивни ефекти от пренаталната диетична и глюкокортикоидна опитност върху експресията на ATR в бъбречната иРНК показва, че алтернативен механизъм трябва да стои зад зависимата от глюкокортикоиди хипертония, може би включваща промени в експресията на ATR в неренална централна или периферна циркулация или променена чувствителност към други вазоактивни съединения (11).

В обобщение, резултатите от това проучване не подкрепят хипотезата, че взаимодействието между експресията на глюкокортикоиди и бъбречната ATR иРНК осигурява механизъм за хранително програмиране на кръвното налягане. Вместо това данните предполагат два независими механизма, действащи по специфичен за пола начин.

Това проучване е финансирано от British Heart Foundation.

СТЪПКИ

Разходите за публикуване на тази статия бяха покрити отчасти чрез плащането на такси за страница. Следователно статията трябва да бъде маркирана с „реклама”В съответствие с 18 U.S.C. Раздел 1734 единствено, за да посочи този факт.

Признаваме техническата помощ на Richard Plant.