Адриан Ман

1 Университет по медицина и фармация, Катедра по микробиология, Търгу Муреш, Румъния

Кристина Николета Чиуреа

2 Университет по медицина и фармация, Търгу Муреш, Румъния

Дан Пасарой

2 Университет по медицина и фармация, Търгу Муреш, Румъния

Ана-Йоана Савин

2 Университет по медицина и фармация, Търгу Муреш, Румъния

Фелисия Тома

1 Университет по медицина и фармация, Катедра по микробиология, Търгу Муреш, Румъния

4 Спешна клинична окръжна болница, Търгу Муреш, Румъния

Флоредана Сулар

3 Университет по медицина и фармация, Катедра по лабораторна медицина, Търгу Муреш, Румъния

4 Спешна клинична окръжна болница, Търгу Муреш, Румъния

Луиджи Сантакроче

5 Университет в Бари Алдо Моро, Университетска болница Поликлинико, Йонийски отдел и Служба по микробиология и вирусология, Бари, Италия

Анка Маре

1 Университет по медицина и фармация, Катедра по микробиология, Търгу Муреш, Румъния

AMan, CNC, DP, AIS и AMare замислиха проучването и извършиха анализа на данните; FS и LS допринесоха за статистическия анализ и прегледаха ръкописа; AMan, FT и AMare изготвиха ръкописа; AMan, FT, FS, LS и AMare преработиха критично ръкописа за интелектуално съдържание. Всички автори прочетоха и одобриха окончателния ръкопис.

Резюме

ЗАДЕН ПЛАН

Връзката между Candida albicans и захарен диабет е добре призната, но не е напълно изяснена.

ЦЕЛИ

Целта на това проучване е да се оцени скоростта на растеж на C. albicans (CA) в присъствието на различни концентрации на глюкоза и фруктоза, две от основните патофизиологични и хранително значими захари при пациенти с диабет, за да се получи по-добро разбиране на стратегията за усвояване на хранителни вещества и нейната възможна връзка с хипергликемичния статус на пациентите с диабет.

МЕТОДИ

Ефектите на различните концентрации на глюкоза и фруктоза (1000 mg%, 500 mg%, 250 mg% и 100 mg% w/v) върху скоростта на растеж на CA са изследвани чрез поточна цитометрия.

КОНСТАТАЦИИ

Установихме, че концентрацията на глюкоза е пряко свързана с растежа на CA, което може да бъде свързано с честите инфекции с дрожди, които се появяват при неконтролирани пациенти с диабет; ние също така показваме, че фруктозата инхибира скоростта на растеж на СА.

ОСНОВНИ ЗАКЛЮЧЕНИЯ

Като последица от нашата хипотеза, проучването показва, че съдържащата фруктоза храна може да предотврати развитието на кандидоза, поне в орални места.

Добре известно е, че захарният диабет е едно от най-разпространените хронични състояния в света, с оценка от 56 милиона случая, разпространение от 8,5% в Европа през 2013 г. и нарастващо (Tamayo et al. 2014). Високата заболеваемост е свързана най-вече с хронични макроваскуларни и микросъдови усложнения като нефропатия, невропатия, ретинопатия, сърдечни усложнения, свързано затлъстяване, но също така и инфекциозни усложнения, дължащи се на хипергликемичната среда (Casqueiro et al. 2012, Tamayo et al. 2014, Gregg и др. 2016). Дрождовите инфекции при пациенти с диабет са често срещани, кандидозата се описва като част от основната инфекциозна патология: кандидоза на устната кухина и хранопровода, пиелонефрит или цистит (Casqueiro et al. 2012). В допълнение, последните прегледи се фокусират върху връзките между оралната микробна флора, хигиената на устната кухина и гликемичния контрол при диабетици (Santacroce et al. 2010, Monea et al. 2017).

Въпреки че връзката между Candida albicans (CA) и захарния диабет е добре призната, тя все още не е напълно изяснена (Soysa et al. 2006). Оралната кандидоза често се причинява от видове albicans и представя много клинични форми (псевдомембранозна кандидоза, свързана с Candida левкоплакия, ъглов хейлит, глосит или стоматит). Candida spp. често се среща при пациенти с лош гликемичен контрол и вече е показано, че повишените нива на слюнчената глюкоза водят до повишено орално носене на Candida (Al-Maskari et al. 2011, Kumar et al. 2014).

Това пилотно проучване in vitro се опитва допълнително да дефинира връзките между високото ниво на глюкоза в кръвта и секретите (включително слюнката) на пациенти с диабет и развитието на кандидоза при тези категории пациенти, като комбинира нашите открития с референции от литературата . Целта на това проучване е да се оцени скоростта на растеж на CA в присъствието на различни концентрации на глюкоза и фруктоза, две от основните физиопатологично и хранително значими захари при пациенти с диабет, за да се получи по-добро разбиране на стратегията за усвояване на хранителни вещества и възможната му връзка с хипергликемичния статус на пациентите с диабет. Проучването in vitro на поведението на Candida в присъствието на глюкоза е опит да се пресъздаде едно от условията, на които тази гъба отговаря в диабетичен организъм. Освен това изследвахме поведението на CA във фруктозна среда, за да получим по-добро разбиране на стратегията за усвояване на хранителни вещества и значението на този заместител на глюкозата от хранителни продукти с диабет върху степента на репликация на Candida.

Предполагаме, че фруктозата, захар, която обикновено се метаболизира по-бавно от глюкозата, ще повлияе отрицателно на растежа на СА. Стандартните измервания на броя на плочите (SPC) и оптичната плътност (OD) са често използвани методи за определяне на микробния растеж (Biesta-Peters et al. 2010). Нашите предишни експерименти (непубликувани данни) показаха, че SPC не е надежден метод за проследяване на скоростта на растеж на CA поради високите вариации между репликите. За да постигнем по-последователни резултати, ние оценихме динамиката на популацията на дрожжевите клетки с помощта на проточен цитометър Apogee A50-Micro (Apogee Flow Systems, UK), специално проектиран за преброяване на малки биологични частици, поради по-доброто му разсейване на светлината (Foladori et 2010 г.).

МАТЕРИАЛИ И МЕТОДИ

Стойностите на CFU/mL за всички проби бяха нормализирани спрямо стойностите, получени при H0 и изразени като Δ-индекс, който компенсира грешките по отношение на инокулата и подготовката на пробата (номерът на CFU в начална точка H0). Второто нормализиране беше извършено между Δ-индекса на пробите и Δ-индекса на контролите (CFU/ml стойности на пробите без добавени захари) и изразено като ΔΔ-индекс, който компенсира вариацията в растежа поради външни или други неидентифицирани фактори, като по този начин го правят по-добър маркер за растеж. Стойността на ΔΔ-индекс, по-висока от една, е еквивалентна на усилване на растежа, докато стойност по-малка от една е еквивалентна на инхибиране на растежа в сравнение с контрола.

В допълнение към нормализираните индекси, ние оценихме скоростта на растеж на час (r) и времето на генериране (g) в минути, които бяха изчислени, използвайки абсолютните числа на CFU/ml, отчетени при H3 в сравнение с H0, съгласно следната формула:

нови

Обяснение: r - темп на растеж; T1 - време за отчитане на пробата (в часове); T0 - начално време (0 часа четене)

Всички статистически оценки бяха извършени в софтуер за електронни таблици и GraphPad InStat3. Прагът на значимост се счита за р-стойност по-малка от 0,05.

РЕЗУЛТАТИ

Наличието на глюкоза и фруктоза показва противоположни ефекти върху скоростта на растеж на CA. Като цяло, глюкозата има стимулиращ ефект, докато фруктозата инхибиращ ефект върху растежа на СА след 9 часа инкубация (Фиг. 1). В абсолютни стойности всички проби показват експоненциален, значителен ръст (p Фиг. 2). Темпът на растеж е пряко свързан с времето за генериране. Присъствието на глюкоза намалява времето за генериране с повече от 20 минути, докато присъствието на фруктоза го увеличава приблизително с 15 минути. В абсолютни стойности съотношението скорост на растеж/час е по-високо при наличие на глюкоза (r = 0,45-0,48), отколкото при наличие на фруктоза (r = 0,25-0,27). Времето на генериране варира между 87-92 минути за глюкоза и 154-166 минути за фруктоза (фиг. 3).

Поточната цитометрия показа популация от дрожди, която беше видима при H0, без съществено различна морфология при H1, която започна да бъде по-добре дефинирана, но все още широко разпространена при H2, и кондензирана и добре дефинирана след 9 часа инкубация (H3). Втора популация, направена от клетъчни остатъци и вероятно частици от хранителната среда, беше забелязана във всички проби и пренебрегвана. Тези тенденции бяха забелязани и при двете захари. За глюкозата, дори в концентрацията, която най-малко стимулира скоростта на растеж на СА, клетъчната популация беше видимо повишена при H2 и H3, в сравнение със съответните разпръснати участъци от фруктоза. Малките клетки на дрожди (млади клетки на СА) се виждат в присъствието на глюкоза в долния ляв ъгъл на затворената зона при H2 (фиг. 4).

ДИСКУСИЯ

Дрожди и гъбички често се съобщават като отговорни за тежки състояния, засягащи цервикалната и лицевата области на пациенти, страдащи от имунни нарушения и диабетици (Giudice et al. 2016), и Candida spp. са най-често срещаните опортюнистични гъбични патогени, CA представляват над 50% от случаите (Minea et al. 2015).

Кандидозата може лесно да бъде разпозната, дори ако други клинични картини могат да симулират същия аспект, като някои синдромни състояния (Marrelli et al. 2012), някои онкологични лезии (Santacroce et al. 2005, Petrovan et al. 2017) или агресивни бактериални инфекции при имунокомпрометирани пациенти или в резултат на инфекции от чужди тела (Inchingolo et al. 2011).

Механизмите на патогенността на CA са ограничени в сравнение с тези, присъстващи в бактериите, което прави тази мая коменсален и опортюнистичен патоген, който присъства в устната кухина при около 75% от населението и активен в случай на неравновесие, свързано с гостоприемника, като бактериално нарушение, имунни нарушения или локални патологии (Jenkinson & Douglas 2002). Хифалните форми с висока инвазивност, бластоспори с висока способност за разпространение, адхезини, инвазини, образуване на биофилми, фактори на околната среда, чувствителни и метаболитна адаптация са част от факторите на патогенността в CA (Mayer et al. 2013). Метаболитната адаптация може да има ключова роля при пациенти с диабет, където нивата на глюкоза са по-високи, отколкото при недиабетни популации, с последици за локална или дисеминирана кандидоза.

Захарите представляват потенциални хранителни източници за дрожди, поне in vitro; глюкозата, фруктозата и галактозата са физиологично значими при хората. Въпреки това, тези захари изглежда не са единствените хранителни източници, тъй като липидите, протеините и аминокиселините са ценни алтернативни източници, особено в тъканите с ниска концентрация на глюкоза (Mayer et al. 2013). Глюкозата и фруктозата засилват CA вирулентността чрез стимулиране на прехода от бластоспори към хифи in vivo (Sabina & Brown 2009). Концентрацията на глюкоза е по-висока, но варира в устната кухина (поради хранителни навици и хигиена на устната кухина), отколкото в кръвта и изглежда, че няма първостепенна роля за тежестта на Candida в устната лигавица, а засилва тежестта на Candida при системни инфекции (Ene et al. 2012). Независимо от това, при пациенти с диабет, за разлика от недиабетните, пропускливостта на базалната мембрана на слюнчените жлези е засегната, което води до „изтичане“ на глюкоза в слюнката (Kumar et al. 2014). Това обяснява защо пациентите с диабет имат висок процент на орална кандидоза.

Увеличението на растежа в присъствието на 1000 mg% глюкоза се забелязва през първите 3 часа инкубация, което отчасти съответства на фазата на изоставане. Това може да се обясни с изобилието на хранителни източници, които осигуряват остра енергия за CA клетките, но имат по-неблагоприятен осмотичен ефект във времето. Вместо това, по-удобната концентрация на глюкоза (100 mg%) осигурява по-добра среда за дългосрочен растеж на CA. Не оценихме ефекта от по-ниските концентрации на глюкоза върху растежа на СА, но можем да подозираме, че той може по същия начин да го стимулира. Тази хипотеза се подкрепя от няколко проучвания, които показват, че при неконтролирани пациенти с диабет, при които нивото на глюкозата в слюнката е по-високо от 12-13 mg/dL, пероралното носене на Candida е по-често (Kumar et al. 2014, Satish et al. 2014) . Други проучвания са идентифицирали пациенти с нива на слюнчената глюкоза от 25-30 mg/dL, които също корелират с висок носител на Candida (Balan et al. 2015). Освен това нивото на глюкозата в слюнката остава високо до 2 часа след прием на храна и/или захар и степента на възстановяване до нормални нива е по-бавна при диабетици, отколкото при пациенти без диабет (Jurysta et al. 2009). Типът храна също играе важна роля в скоростта на изчистване на захарта (Nirmala et al. 2016), поради което високите нива на слюнчената глюкоза наистина са постижими и могат да благоприятстват колонизацията на Candida.

Знаем, че рискът от инфекция с Candida, докладван за пациентите със захарен диабет, има многофакторна причина. В допълнение към състоянието на диабет, високият прием на захар, лошите хранителни навици или лошата устна хигиена са фактори, които допринасят за високите нива на слюнчената глюкоза и са благоприятни фактори за кандидоза на устната кухина. Независимо от това, в този контекст нашето проучване предоставя допълнителни доказателства относно пряката връзка между концентрацията на глюкоза и кандидозата.

В допълнение, нашите резултати предоставят информация за способността за гъбична гъбичка в богата на фруктоза среда, което повдига въпроса дали фруктозната диета е защитен фактор срещу кандидоза на устната кухина. Приемът на фруктоза, като част от диетичната храна (заместител на захарта) при диабет, може да играе защитна роля срещу кандидоза на устата при тези пациенти. PubMed търсенето на термините („кандида/метаболизъм“) И „фруктоза“ разкрива 40 резултата, като всички те се отнасят до други видове Candida, освен до албиканци. Това пилотно проучване предоставя нова информация за метаболизма на C. albicans, свързан с фруктозата и приема на фруктоза, която се среща особено при пациенти с диабет. Предишни проучвания показват, че диабетът може удобно да се индуцира при плъхове (Scridon et al. 2015), така че тези експериментални модели ще бъдат обект на бъдещи експерименти in vivo по отношение на скоростта на растеж и инфекциозния потенциал на CA. Имайки предвид това, това проучване има за цел да подчертае значението на правилния клиничен подход към пациентите с диабет, също и от гледна точка на грижите за устната кухина: дълбокото познаване на състоянието на устната кухина е важно за намаляване на системните усложнения на някои патогенетични механизми (Santacroce et al. 2010).

В заключение, in vitro анализът на скоростта на растеж на CA чрез поточна цитометрия е нова алтернатива за други често използвани методи, като измерване на оптична плътност или стандартен брой плочи, което позволява диференциацията на популациите от дрождни клетки. Нашите резултати показаха, че има положителна връзка между броя на CA клетките и хипергликемичната среда, като по този начин се предоставят допълнителни доказателства за високата честота на CA инфекции при пациенти с лошо управление на глюкозата. Освен това показахме, че фруктозата увеличава времето за генериране на CA, като по този начин инхибира скоростта на растеж. Въпреки че има доказана взаимозависимост между концентрацията на фруктоза и скоростта на растеж на CA, връзката между стойностите все още е отворена за дебат. Това изследване допринася силно за познаването на многобройните пътища, които влияят на устната кухина и нейната микробиота: то също така отбелязва значението на мултидисциплинарния подход към оралните патологии (Mangini et al. 2006). Всъщност корелациите между системните заболявания и оралните прояви имат много връзки, които всъщност не са напълно разбрани, следователно заслужават по-нататъшни изследвания от научната общност (Santacroce et al. 2008).